گزارش نهایی طرح تحقیقاتی بررسی جداسازی، شناسایی و تعیین هویت مولکولی اورنیتوباکتریوم رینو تراکیال از نمونه های طیور ارجاعی به موسسه رازی

اورنیتوباکتریوم رینوتراکیال ‭(ORT) ‬به صورت یک عامل بیماریزای باکتریایی نوظهور در گله های ماکیان و بوقلمون شناخته شده است. هدف از این مطالعه در ابتدا جدا سازی و شناسایی باکتری ‭ORT ‬با کمک روش های میکروبیولوژی و سپس تعیین هویت مولکولی آنها بود. به منظور جدا سازی و شناسایی اولیه باکتری از محیط کشت غنی شده با خون و آزمونهای بیوشیمیایی استفاده گردید. واکنش زنجیره ای پلی مراز‭(PCR)‬، انگشت نگاری به روش ‭ERIC-PCR ‬و تعیین توالی نوکلیوتیدی ژن ‭rRNA ‬‮‭16‬ ‭S ‬به ترتیب برای شناسایی مولکولی و تعیین هویت جدایه به کار گرفته شدند. جمع آوری نمونه برای کشت باکتری، از دستگاه تنفسی جوجه های گوشتی، مرغهای تخمگذار تجاری و مرغهای مادر از چندین ناحیه جغرافیایی مختلف کشور، ارجاعی به موسسه رازی طی سالهای ‮‭1378‬ تا ‮‭1388‬ انجام شده بود. تشخیص عفونت ‭ORT ‬با برخی مشکلات در کشت و شناسایی قطعی باکتری با کمک خواص بیوشیمیایی آن مواجه بوده است. دسترسی به یک روش شناسایی قطعی و قابل اتکا که بتواند در پژوهشهای آزمایشگاهی متداول بکار آید، حایز اهمیت می باشد. در این مطالعه امکان تشخیص مولکولی ‭ORT ‬با استفاده از یک روش کاملا اختصاصی واکنش زنجیره ای پلیمراز ‭(PCR )‬، بر اساس تکثیر قطعه ای از ژن ‭rRNA ‬‮‭16‬ ‭S ‬، بررسی گردید. به منظور راه اندازی این ‭PCR ‬از پرایمرهای ‭OR‬‮‭16‬‭S-F‬1 و ‭OR‬‮‭16‬‭S-R‬1 ، باکتریهای شناخته شده ‭ORT ‬و 7 گونه باکتری دیگر، نظیر هموفیلوس پاراگالیناروم و پاستورلا مولتوسیدا، به ترتیب به عنوان کنترلهای مثبت و منفی استفاده شد. روش استخراج فنل و کلروفرم برای تهیه ‭DNA ‬از نمونه ها به کار رفت. ‮‭60‬ نمونه تجمیع شده بدست آمده از نای و سینوس زیر چشمی ‮‭30‬ گله جوجه گوشتی کشتار شده در یکی از کشتارگاههای منطقه قزوین، از نظر آلودگی به ‭ORT ‬با هر دو روش کشت و ‭PCR ‬بررسی شدند. یک باند ‮‭784‬ جفت بازی در 5 نمونه کنترل مثبت ‮‭19‬ ، ‭ORT ‬مورد از ‮‭60‬ نمونه اولیه، شامل ‮‭11‬ نمونه هموژنیزه نای و 8 نمونه سواب سینوس زیر چشمی و در تمامی‮‭16‬ نمونه باکتریهای جدا شده و مشکوک به ‭ORT ‬دیده شد؛ ولی در 7 مورد باکتری کنترل منفی مشاهده نگردید. در یک مورد از ‮‭41‬ نمونه اولیه منفی شده در ‭PCR ‬، باکتری ‭ORT ‬با کمک کشت جداسازی گردید و این باکتری تکثیر شده در آزمایش مجدد ‭PCR ‬مورد شناسایی قرار گرفت. پانزده مورد از ‮‭30‬ گله ( %‮‭50‬) در آزمایش ‭PCR ‬مثبت تشخیص داده شدند و تنها یک مورد از آنها در کشت باکتریایی منفی شد. بر اساس نتایج بدست آمده ؛ ‭PCR ‬بکار رفته در این مطالعه می تواند برای شناسایی مطمین و سریع ‭ORT ‬در نمونه های مشکوک به عفونت ‭ORT ‬استفاده شود، اما بهتر است که به منظور به حداکثر رساندن تشخیص عفونت، با روش کشت توام باشد. 6 جدایه از ‮‭14‬ جدایه استان قزوین به همراه ‮‭19‬ جدایه از ‮‭70‬ جدایه از استانهای مرکزی، البرز، قم، اصفهان، گیلان و مازندران برای مرحله بعدی مطالعه، انتخاب شدند. در روش انگشت نگاری ‭ERIC-PCR ‬تمامی ‮‭25‬ جدایه مورد مطالعه، تقریبا ‮‭19‬ باند بین ‮‭1.0‬ تا ‮‭5.2‬‭kb ‬را نشان دادند و بارزترین باندها در ناحیه ‮‭2.1‬‭kb ‬واقع شده بود که می تواند به دلیل تکراری بودن کپی آن در ژنوم باکتری و یا تفاوت جزیی چند باند بسیار نزدیک به هم و بر اساس یک یا چند نوکلیوتید باشد. تمامی ‮‭25‬ جدایه در آزمون ‭ERIC-PCR ‬پروفایل ژنتیکی یکسانی را نشان دادند و متعلق به یک ژنوتیپ بودند که بسیار شبیه ژنوتیپ ‭A ‬در سایر مطالعات بود. سپس با کمک پرایمرهای اختصاصی ژن کامل ‮‭16‬‭S rRNA‬، آزمون ‭PCR ‬دیگری راه اندازی گردید و قطعه حدود ‮‭1400‬ جفت بازی، تکثیر و تخلیص شده و توالی نوکلیوتیدی آنها مشخص گردید. همردیف کردن، مقایسه توالی های نوکلیوتیدی و آنالیز فیلوژنیک در برنامه های ‭Bioedit ‬و ‭MEGA ‬انجام شد. آنالیز فیلوژنیک جدایه های ‭ORT ‬نشان می دهد که ؛ ‭ORT ‬های جدا شده در این بررسی به همراه ‭ORT ‬های اخذ شده از بانک ژن، در سه دودمان (شاخه) نزدیک به هم، قرار گرفته و تمامی ‮‭25‬ جدایه در یک شاخه واقع شده اند. تشابه صد درصد ‮‭25‬ جدایه‭ORT ‬از مناطق متفاوت کشور طی سالهای ‮‭1388-1378‬ ، از لحاظ توالی ژن ‮‭16‬‭S rRNA ‬با یکدیگر و همچنین تشابه زیاد(‮‭98/6‬ تا ‮‭100‬ درصد) آنها با ‮‭63‬ جدایه دیگر از سراسر دنیا ، مشاهده گردید. بیشترین قرابت جدایه های مطالعه حاضر با جدایه های کشور آمریکا، روسیه، تایوان دیده شد. به طور کلی نتایج این بررسی نشان داد که جدایه های ‭ORT ‬صنعت ماکیان تجاری کشور در مطالعه حاضر، از نظر ساختار مولکولی نزدیک به هم بوده و همو ژنیتی بین آنها وجود دارد و این جدایه ها از یک گروه کلون کوچک و نزدیک به هم منشا گرفته اند. یافته های این تحقیق موید آن است که استراتژی واکسیناسیون به منظور کنترل بیماری در صنعت طیور کشور احتمالا موفقیت آمیز خواهد بود. واژه های کلیدی: اورنیتو باکتریوم رینوتراکیال‭(ORT)‬، واکنش زنجیره ای پلی مراز‭) (PCR‬، انگشت نگاری ‭ERIC-PCR‬، تعیین توالی نوکلیوتیدی ژن ‮‭16‬‭S rRNA