جداسازی و بررسی بیان موقت و اختصاصی ژن ‭HBsAg ‬با استفاده از سیستم اگرواینفیلتریشن در گوجه فرنگی و سیب زمینی

یکی از مهمترین کاربردهای گیاهان تراریخته در کشاورزی مولکولی تولید واکسن های نوترکیب است که در آن گیاهان به عنوان بیوراکتوری برای تولید پروتیین های آنتی ژن عمل نموده و برای تولید واکسن اختصاصی بر علیه یک بیماری بکار گرفته می شوند. تولید واکسن هپاتیت ب در گیاهان و در میوه های خوراکی می تواند از نظر اقتصادی یک جایگزین مناسب برای روش های سنتی باشد. بدین منظور، در این پروژه ژن ‭HBsAg ‬با استفاده از پرایمرهای اختصاصی از ویروس هپاتیت جدا شد.. پس از استخراج ‭DNA ‬ژنومی از گیاهان گوجه فرنگی و سیب زمینی، پیشبرهای E8، 2A‮‭11‬ و ‭PatI ‬با استفاده از پرایمرهای اختصاصی هر یک از پیشبرها، در ناقل همسانه ساز ‭PTZ‬‮‭57‬‭R/T ‬همسانه سازی شدند. سپس پلاسمیدهای نوترکیب در سویه ‭XLI-blue ‬باکتری ‭E.coli ‬تراریخت گردید و سلول های ‭LacZ ‬غربال گردیدند . قطعه های مورد نظر با دو آنزیم برشی ‭BamH‬1 و ‭HindIII ‬جدا و خالص سازی شده وجایگزین پیشبر دایمی ‭CaMV‬‮‭35‬‭S ‬در ناقل دوگانه ‭pBI‬‮‭121‬ گردیدند. ناقل دوگانه ‭pBI‬‮‭121‬ با دارا بودن ناحیه ‭T-DNA ‬حاوی ژن گزارشگر ‭gus ‬و پیشبر ‭CaMV‬‮‭35‬‭S ‬واجد مشخصات لازم جهت استفاده برای انتقال ژن از طریق اگرواینفیلتریشن به گیاه بود و به همین دلیل به عنوان ناقل هدف جهت کلون سازی پیشبرهای E8، 2A‮‭11‬ و ‭PatI ‬و ژن ‭HBsAg ‬انتخاب شد. پلاسمیدهای نوترکیب به روش شوک حرارتی به ‭Agrobacterium tumefaciens ‬سویه ‭LBA‬‮‭4404‬ منتقل گردید. با استفاده از روش اگرواینفیلتریشن بیان اختصاصی ژن ‭gus ‬در بافت های گیاهان گوجه فرنگی و سیب زمینی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل نشان داد که در مقایسه با پیشبر ‭CaMV‬‮‭35‬S، پیشبرهای E8، 2A‮‭11‬ و ‭PatI ‬نیز با کارایی بالایی باعث بیان ژن ‭gus ‬در میوه ها و غده ها می شوند. پس از تایید پلاسمیدهای نوترکیب، ژن ‭HBsAg ‬با دو آنزیم ‭BamHI ‬و ‭SacI ‬از ناقل ‭pMA-T ‬جدا شد و تحت کنترل پیشبر عمومی ‭CaMV‬‮‭35‬‭S ‬و پیشبرهای E8، 2A‮‭11‬ و ‭PatI ‬جایگزین ژن ‭gus ‬در ناقل دوگانه ‭pBI‬‮‭121‬ شد. سپس پلاسمیدهای نوترکیب در سویه ‭XLI-blue ‬باکتری ‭E.coli ‬تراریخت گردید. با هضم آنزیمی حضور ژن ‭HBsAg ‬تایید شد. نتایج حاصل از بررسی بیان موقت آنتی ژن ‭HBSag ‬در میوه های گوجه فرنگی و غده سیب زمینی حاکی از کارایی عملکرد این پیشبرهای اختصاصی بافت در گیاهان است. در ادامه تلاش خواهد شد این ژن ها برای تولید گیاهان تراریخت دایمی مورد استفاده قرار گیرند. واژه های کلیدی: آنتی ژن ‭HBsAg‬، الایزا، اگروباکتریوم، بیان موقت، تراریختی، هپاتیت ب، واکسن