راه اندازی روش ‭Real time PCR ‬برای تشخیص و تعیین کمی ویروس سرخک

سرخک بیماری بسیار مسری است که متاسفانه هنوز در کشور های در حال توسعه جز عوامل مرگ و میر کودکان است. ویروس سرخک عضو خانواده پارامیکسوویروس و جنس موربیلی ویروس با ژنوم ‭RNA ‬تک رشته ای بدون سگمانته می باشد. روش های متعددی برای شناسایی و تشخیص این ویروس تاکنون ارایه شده است. این روش ها شامل روش های ایمونولوژیک و روش های مولکولی بر مبنای ‭RT-PCR ‬می باشد. یکی از اشکالات روش های مبتنی بر ‭PCR ‬عدم امکان کمی کردن آن می باشد اشکال دیگر این روش ها زمان نسبتا طولانی بر حصول به جواب مثبت یا منفی می باشد. اخیرا روش ‭Real Time PCR ‬معرفی و مطرح شده است که این دو اشکال ‭PCR ‬در آن مرتفع گردیده است. در این روش با کوتاه شدن زمان ‭PCR ‬و قابلیت ارزیابی در حین انجام آن، امکان تعیین کمی ژنوم هدف نیز فراهم میگردد. اگرچه روشهای متداول ‭CCID‬‮‭50‬ و ‭Plaque Assay ‬امروزه بطور گسترده جهت تعیین کمیت و کنترل کیفی فرآورده های بیولوژیکی استفاده میشودکه زمان طولانی نیاز دارد. بنظر میرسد استفاده از روش های مولکولی به لحاظ سرعت، دقت ، حساسیت و معتبر بودن نتایج شان در بسیاری از مراکز علمی و تحقیقاتی مورد توجه میباشد و دسترسی به روش بسیار حساس ‭Real Time RT-PCR ‬برای تشخیص و تعیین کمیت‭RNA ‬ویروس سرخک و ارزیابی کیفیت درفرآوردهای بیولوژیکی و به دنبال آن کنترل این بیماری ضروری وبسیار ارزشمند باشد. در این تحقیق پس از تخلیص ‭RNA ‬ویروس، واکنش نسخه برداری معکوس با هگزامر پرایمر صورت گرفت و ‭cDNA‬ژنومی تهیه گردید. حال با استفاده از هگزامر پرایمر و ساخت ‭cDNA‬و تبدیل آن به ‭DNA ‬دو رشته ای بوسیله پرایمر های اختصاصی و همسانه سازی در درون پلاسمید ‭pTZ‬‮‭57‬‭R/T ‬کلونینگ با موفقیت انجام شد و پس از تخلیص پلاسمید با حداکثر خلوص لازم براساس فرمول کپی نامبر، تعدادکپی ژن هدف را دقیقا محاسبه نمودیم .سپس از پلاسمید حاوی ژن رقت های متوالی ده تایی تهیه و با پرایمر های اختصاصی منحنی استاندارد رسم شد. سه قطعه ،‮‭115 75‬ و ‮‭437‬ جفت بازی در این مطالعه بروش ‭PCR ‬معمولی و ‭Real Time PCR ‬مقایسه شد و دو تکنیک ‭Cybr Green ‬و ‭TaqMan ‬استفاده شد. بین دو تکنیک ‭PCR ‬معمولی و‭Real-Time PCR ‬با استفاده از سایبرگرین افزوده دستی پس از اپتیمایز شدن واکنش برای قطعه ‮‭438‬ ‭bp ‬تنهاحدود یک ‭Log‬‮‭10‬ اختلاف حساسیت وجود داشت اما بین تکنیک ‭PCR‬معمولی و‭Real-TimePCR ‬با استفاده از سایبرگرین برای قطعات (‮‭115‬‭- bp ‬‮‭75‬‭bp) ‬حدود3 ‭log‬‮‭10‬ اختلاف حساسیت وجود داشت. بادرنظر گرفتن کلیه پارامتر های کیفی لازم برای رسم یک منحنی استاندارد دقیق، کیفیت منحنی استاندارد تهیه شده بعنوان مرجع کمیت سنجی در این پروژه برای هر دو روش ‭Taqman‬و ‭SYBR Green‬کاملا تایید شده است.در ‭PCR‬معمولی محدوده پاسخ تست( ‮‭6-10-1-10‬) معادل (‮‭44.5‬ ا ‮‭49.5‬) اما در ‭Real-Time PCR ‬محدوده پاسخ تست ‮‭9-10-1-10‬)) معادل ‮‭41.5‬)ا (‮‭9 4.5‬کپی در هر ریکشن بود. بهر صورت تفاوت واضح حدود 3 ‭log‬‮‭10‬ نشاندهنده حساسیت بیشتر روش ‭Real-Time PCR ‬می باشد . برای ارزیابی خطی بودن‭linearity)) ‬روش ‭Real-Time PCR ‬رقت های ده مرتبه ای از پلاسمید حاوی ژن یعنی رقت های‮‭1-10‬ا‮‭9-10‬ معادل (‮‭4.5‬ا‮‭109‬ض ‮‭4.5‬ا‮‭101‬ کپی) را برای هردو تکنیک ‭ Taqman‬و ‭SYBR Green‬آزمایش کردیم. برای روش‭Taqman ‬در بین رقت های ‮‭5-10‬ا‮‭9-10‬ معادل) (‮‭4.5‬ا‮‭105‬ض ‮‭4.5‬ا‮‭101‬کپی بهترین حالت خطی با ‮‭997.0‬‭=R‬2 دیده شد بنابراین ‭LoD(Limitation of Detection ( ‬واکنش برابر ‮‭4.5‬ا‮‭101‬ می باشد. برای روش ‭SYBR Green‬در بین رقت های ‮‭5-10‬ا‮‭9-10‬ معادل ) (‮‭4.5‬ا‮‭105‬ض ‮‭4.5‬ا‮‭101‬کپی بهترین حالت خطی با ‮‭999.0‬‭=R‬2 رسم شد و ‭LoD‬این روش نیز برابر ‮‭4.5‬ا‮‭1 10‬ می باشد. بنابراین متدهای ‭SYBR Green‬و ‭Taqman ‬راه اندازی شده با استفاده از ‭DNA plasmid Standard Curve ‬باتوان تشخیص حداقل‮‭54‬ کپی ژنوم هدف ویروس در هر میکرولیتر در مقایسه با مقالات گزارش شده بسیار دقیق و معتبر می باشد .لازم به ذکر است که پرایمر ها و پروب استفاده شده در این پروژه می تواند 5 کپی ژنوم هدف در هرمیکرولیتر را شناسایی کند اما به لحاظ اینکه این نتیجه در تمام واکنشها تکرار پذیری نداشت گزارش نگردید.