ساخت سازه کلروپلاستی حاوی ژن های کاندید دخیل در تحمل به تنش غیرزنده و انتقال آن به برنج

تنشهای غیرزیستی از جمله خشکی و شوری اولین عامل کاهش محصول در دنیا است. در این تحقیق ژن بتایین آلدهید دهیدروژناز‭(badh) ‬به عنوان یک نشانگر غیر آنتی بیوتیک و همچنین به عنوان یکی از ژنهای کاندید در تحمل به تنشهای غیرزیستی به همراه ژن فلاودکسین‭(fld) ‬در ساخت وکتور کلروپلاستی برای گیاه برنج مورد استفاده قرار گرفت. سپس طراحی کاست ژنی برای ژن های ‭fld ‬و‭badh ‬تحت نواحی تنظیمی کلروپلاستی انجام شد، به طوریکه ژن ‭fld ‬همراه با ‭ rbcl ‬5‭'UTR(‬رابیسکو) و ژن ‭badh ‬همراه با T7‭gene‬‮‭5 10‬‭'UTR ‬به صورت پلی سیسترونی تحت پیشبر قوی کلروپلاستی ‭Prrn ‬و پایانبر ‭rbcl ‬3‭'UTR ‬همسانه سازی شدند. سرانجام کاست کامل دو ژنی ‭fld/badh ‬به همراه نواحی تنظیمی از وکتور نوترکیب حاصل موسوم به ‭pBF ‬جدا و در مرکز ناحیه هدف گیری کننده به کلروپلاست برنج در دو جهت کلون شد. در این تحقیق به منظور تولید گیاه برنج تراریخته متحمل به تنشهای غیر زنده با واسطه اگروباکتریوم از سویه ‭EHA‬‮‭105‬ و حامل پلاسمیدی p6‭-ubi ‬استفاده شد. این وکتور حاوی ژن نشانگر باکتریایی استروپتومایسین و نشانگر گیاهی هیگرومایسین و ژن فلاودکسین ‭(fld) ‬میباشد. بدین منظور از کالوسهای جنین زای برنج رقم هاشمی به عنوان بافت هدف استفاده شد. کالوسها پس از آلوده شدن با سوسپانسیون باکتری، به محیط هم کشتی منتقل و پس از گذشت 3 روز به محیط کشت انتخابی حاوی ‮‭400‬ میلی گرم در لیتر آنتی بیوتیک سفوتاکسیم جهت کنترل رشد باکتری انتقال داده شدند. پس از یک هفته به محیط کشت انتخابی حاوی ‮‭50‬ میلیگرم هایگرومایسین و‮‭250‬ میلی گرم سفوتاکسیم منتقل گردیدند. سپس کالوس-های تراریخت احتمالی به محیط باززایی حاوی 3 میلی گرم در لیتر نفتالین استیک اسید و2 میلی گرم بر لیتر کاینتین منتقل شدند. جهت ریشه زایی از محیط ریشه زایی حاوی 2/. میلی گرم بر لیتر نفتالین استیک اسید استفاده شد. گیاهان باززا شده به لولهصهای آزمایش ‮‭20‬ سانتیمتری حاوی محلول یوشیدا منتقل شدند. آنالیز‭PCR ‬باپرایمرهای ‭VirG‬، عدم آلودگی به اگروباکتریوم، و با پرایمرهای ‭fld ‬، حضور حداقل یک نسخه از ژن ‭fld ‬در ژنوم این گیاهان را نشان داد. در روش دوم به منظور دستیابی به برنج تراریخته فاقد ژن نشانگر آنتی بیوتیکی، از پلاسمیدهای کلروپلاستی ‭(pFrFB(- ‬و ‭pFrFB(+) ‬ساخته شده استفاده شد. این پلاسمیدها به کالوس های جنین زایی که از ناحیه اسکوتلوم بذور رسیده رقم هاشمی منشا گرفته و دارای توان تقسیم سلولی و باززایی بالایی بودند، به روش ریزپرتابه منتقل شدند. بلافاصله پس از بمباران، کالوسها به محیط کشت باززایی ‭MS ‬منتقل میشدند. نحوه گزینش کالوس های تراریخته بدین صورت بود که وقتی طول گیاهچههای باززاشده از ‮‭10‬ سانتیمتر بیشتر میشد، از پتری خارج شده و یک برگ ‮‭3-5‬ سانتیمتری از آنها جدا میشد و برای استخراج ‭DNA ‬استفاده می-شد.آنالیز‭PCR ‬باپرایمرهای ‭fld ‬نشان داد، حداقل یک نسخه از ژن در ژنوم این گیاهان وجود دارد. کلمات کلیدی: بتایین آلدهید دهیدروژناز، فلاودکسین، تنشهای غیرزنده، همسانه سازی، وکتور کلروپلاستی