بررسی تولید گیاه تراریخته سیب زمینی مقاوم به ویروس ‭PVY ‬با استفاده از سازه های ساخته شده ‭RNAi‬

1- چکیده استفاده از مکانیسم های ایجاد مقاومت ناشی از پاتوژن افق های جدیدی در راستای تولید گیاهان تراریخت مقاوم به ویروس باز کرده است. این نوع مقاومت ناشی از ویروس در گیاهان تراریخت از طریق بیان بخشی از ژنوم خود ویروس ایجاد می شود. یکی از بیماری های مهمی که سالانه خسارت های اقتصادی بسیاری به کشاورزان کشور وارد می کند و باعث افت عملکرد و کیفیت محصول می گردد، ویروس ‭Y ‬سیب زمینی است. این پژوهش در راستای تولید سیب زمینی تراریخت مقاوم به ویروس ‭PVY ‬با استفاده از مکانیسم خاموشی ژن انجام گردید. بدین منظور سه سازه ژنی بر گرفته از بخش پروتیین پوششی ‭(CP) ‬و بخشی از ناحیه غیرترجمه شونده ‭(UTR) ‬ژنوم ویروس ‭PVY ‬طراحی گردید. سپس همسانه سازی سازه ها در ناقل پلاسمیدی ‭pCAMBIA‬‮‭3300‬ انجام شد. این پلاسمید حاوی ژن ‭bar ‬کدکننده آنزیم فسفینوتریسین استیل ترانسفراز ‭(PAT)‬، پیشبر ویروس موزاییک کلم ‭(CaMV ‬‮‭35‬‭S) ‬و پایان دهنده اکتوپین سینتاز می باشد. پلاسمیدهای مورد نظر به سویه اگروباکتری ‭AGL‬1 تراریزش شدند. به منظور تایید کارایی سازه های خاموشی ژن بیان موقت آن ها با روش تزریق ‭Agrobacterium tumefaciens ‬مورد ارزیابی قرار گرفتند. بر اساس نتایج آزمون های ملکولی لکه گذاری پروتیین، الایزا، لکه گذاری نوردرن و ‭RT-PCR ‬هر سه سازه توانایی ایجاد مقاومت در برابر هر دو سویه ‭N ‬و ‭O ‬ویروس ‭PVY ‬نشان دادند. از بین سه سازه ‭CP+UR ‬میزان کارایی بالاتری از خود نشان داد. کمترین مقدار خوانش الایزا و عدم وجود هیچ نوع آلودگی پروتیینی و ‭RNA ‬ویروسی در گیاهان تزریق شده با سازه ‭CP+UR ‬مشاهده شد. سپس انتقال دایم ژن های ‭RNAi ‬مقاومت به ‭PVY ‬به گیاه سیب زمینی از طریق میزبان حدواسط ‭Agrobacterium tumefaciens ‬سویه ‭AGL‬1 حامل پلاسمیدهای ‭pCAMRNAiCP‬، ‭pCAMRNAiUR‬و ‭pCAMRNAiCP+UR ‬انجام گردید. گیاهان تراریخت احتمالی با آغازگرهای اختصاصی توالی های سنس و آنتی سنس ژن های ‭CP‬، ‭UR ‬و ‭CP+UR ‬و همچنین قطعه اینترون ‭(SPS) ‬بین سنس و انتی سنس و ژن ‭bar ‬مورد تایید قرار گرفتند. نتایج حاصل از آزمون ‭RT-PCR ‬در گیاهان تراریخت نشان داد که 8 گیاه انتخاب شده از بین لاین ها بیان ژن ‭bar ‬را تایید کردند. بیان و تایید تراریختی گیاهچه های باززا شده با استفاده از آزمون های ‭RT-PCR ‬و لکه گذاری سادرن به تایید رسید. به منظور زیست سنجی مقاومت به ‭PVY ‬گیاهان تراریخت سیب زمینی آزمون های ‭RT-PCR ‬جهت ردیابی ‭PVY RNA‬، لکه گذاری پروتیین پوششی ‭PVY ‬و الایزا انجام شد. زیست سنجی مقاومت به ‭PVY ‬گیاهان تراریخت سیب زمینی نشان داد که حدود ‮‭77‬ درصد گیاهان با نتیجه ‭PCR ‬مثبت نسبت به آلودگی ‭PVY ‬با کمترین مقدار غلظت آلودگی (خوانش الایزا ‮‭0/19‬ در طول موج ‮‭405‬) مقاومت نشان دادند. گیاهان تراریخت سیب زمینی در برابر هر دو سویه ‭N ‬و ‭O ‬مقاومت داشتند. اگر چه آلودگی ناشی از سویه ‭PVYN ‬در مقایسه با ‭PVYO ‬شدیدتر بود. هیچ نوع ناهنجاری فنوتیپی در گیاهان تراریخت مشاهده نگردید. از شش لاین مورد بررسی در آزمون سادرن چهار لاین دارای ژن تک نسخه و دو لاین دارای ژن دو نسخه ای بودند. مقایسه بین تاثیر سه ژن ‭CP+UR‬، ‭UR ‬و ‭CP ‬در ایجاد مقاومت به ‭PVY ‬در سیب زمینی نشان داد که بیشترین مقاومت مربوط به ‭CP+UR ‬با کمترین مقدار خوانش ‭ELISA ‬و کمترین مقاومت مربوط سازه ‭CP ‬با ظهور آلودگی در برخی از لاین ها با تاخیر در روز ‮‭35‬ام بعد از آلودگی بود. واژه های کلیدی: تراریختی، خاموشی ژن، سیب زمینی، مقاومت، ، ویروس، ‭PVY‬، ‭RNAi