کلونینگ و بیان مقدماتی ژن کلون شده‭HA03 ‬در سیستم بیانی یوکاریوتی پیشیا پاستوریس

ژن ‭HA‬‮‭03‬ از روده میانی کنه غالب ایران، هیالوما آناتولیکوم آناتولیکوم، جدا شده و توالی آن در بانک ژن ثبت گردیده است. این ژن همولوگ ژن ‭BM‬‮‭86‬ جدا شده از کنه بوافیلوس میکروپولوس می باشد که پروتیین کد شونده توسط آن در ساخت واکسن های نوترکیب ضدکنه موجود مورد استفاده واقع شده است. با توجه به اینکه واکسن های موجود ضد کنه تاثیر کمی روی کنه های بومی ایران داشته و همچنین تحقیقات نشان می دهد که استفاده از آنتی ژن های اختصاصی هرگونه برای ساخت واکسن علیه همان گونه بسیار موثرتر میباشد، لذا ساخت واکسن بر پایه آنتی ژن ‭HA‬‮‭03‬ علیه ایزوله های ایرانی امری ضروری می باشد. به منظور لازم است ساختار، ویژگی این ژن مطالعه شده و میزان ثبات آنتی ژنیک و ایمونوژنیسیته آن بعنوان واکسن بررسی گردیده، و سپس بیان این آنتی ژن در یک سیستم مناسب بررسی گردد. برای دستیابی به این اهداف این پروژه با 5 طرح تدوین گردید. این ژن قبلا توسط اینجانب و همکاران جدا سازی و شناسایی شده و بنام ‭HA‬‮‭03‬ در بانک ژن ثبت شده بود. با توجه بطول بلند این ژن که حدود ‮‭2200‬ جفت باز می باشد کلون کردن در داخل وکتور مناسب راحت نمی باشد و برای هر گونه مطالعات بعدی نیاز به یک نسخه ثابت و قابل دسترس از آین ژن بود. این طرح با عنوان کلون کر یهدستیابی به این پروتیین، در این تحقیق آنتی ژن ‭HA‬‮‭03‬ در سویه ‭KM‬‮‭71‬‭H ‬مخمر پیشیا پاستوریس بیان گردید. ابتدا با پرایمرهای حاوی سایت برشهای مناسب، این ژن از وکتور کلونینگ ‭pTZ‬‮‭57‬‭R ‬جدا شده و تکثیر گردید. سپس ژن مذکور به وکتور بیانی ‭pPICZB ‬منتقل گردید. آنگاه وکتور حاوی ژن هدف به سلول ‭DH‬5 باکتری ‭E.coli ‬ترنسفورم گردید. برای اطمینان از مراحل کلونینگ، حضور ژن درون وکتور با روشهای ‭PCR ‬و هضم آنزیمی مورد ارزیابی قرار گرفت. پس از تایید صحت کلونینگ ژن هدف، ‭HA‬‮‭03‬، با روش الکتروپوریشن وارد سلول ‭KM‬‮‭71‬‭H ‬مخمر پیشیا پاستوریس شده و بیان ژن در این سلول انجام شد. پس از بیان، پروتیین نوترکیب تولید شده با روشهای ‭SDS-PAGE ‬و وسترن بلات مورد بررسی و تایید قرار گرفت. کلمات کلیدی: واکسن نوترکیب- کنه هیالوما آناتولیکوم آناتولیکوم- مخمر پیشیا پاستوریس- آنتیصژن ‭HA‬‮‭03‬