بیان پروتیین نورآمینیداز ویروس آنفلوانزای سویه ( H1N1 )

از آنجاییکه ویروس آنفلوانزای فصلی دارای خطر بروز همه گیری بالقوه در سرتاسر جهان میباشد و از طرفی در افراد مسن، خرد سالان و بیماران خاص ، بیماری شدید تا حد مرگ ایجاد میکند لذا محققین سراسر دنیا به مطالعه در مورد تمامی پروتیین های ویروس آنفلوانزا همت گماشته اند تا بتوانند قبل از همه گیری بعدی بیماری آنفلوانزا، واکسنی موثر ، کارا و با کیفیت مطلوب را به جامعه جهانی عرضه کنند. یکی از مهمترین پروتیین های سطحی ویروس آنفلوانزا که بعد از هماگلوتینین بیشترین توجهات را به خود جلب کرده است، گلیکوپروتیین سطحی ویروس آنفلوانزا یعنی نورآمینیداز میباشد. گفته شده است آنتی بادی ساخته شده بر علیه نورآمینیداز میتواند تا مقدار قابل ملاحظه ای از شدت و حدت بیماری بکاهد. دراین تحقیق در مرحله اول برای بدست آوردن ژن نورآمینیداز ویروس آنفلوانزای سویه واکسینال H1N1 ، ویروس مذکور در تخم مرغ SPF کشت داده شد و سپس بوسیله RT-PCR مقدار زیادی cDNA تولید گردید . ژن مذکور آمپلی فای شده و با سیستم بیانی Bac-To-Bac باکیولوویروس دروکتور pFastBAC HTA کلون گردید . ژن در باکتری اشریشیا کلای سویه TOP10 ترانسفورم شد . سپس حضور ژن روی پلاسمید pFastBAC HTAدر باکتری TOP10 بوسیله پرایمرهای اختصاصی تایید شده و سکونس انجام گردید. قطعه از TOP10 تخلیص و درباکتری اشریشیا کلای سویه DH10 ترانسفورم شد . بعد از تایید ترانسفورمیشن و ایجاد بکمید نوترکیب و رویت قطعه bp 1400 در ژل آگارز 1% و تاییدکشت باکتری در محیط X-GAL ، بکمید به سلول حشره Sf9 ترانسفکت شده و ویروس در آن تولید شد و سعی گردید بوسیله پاساژهای متوالی عیار باکیولو ویروس افزایش داده شود. لیز سلولی انجام شده و پروتیین هدف پس از تغلیظ ، بوسیله روش SDS-PAGE و وسترن بلاتینگ به وزن حدود 41کیلو دالتون تایید شد. علاوه بر این، بوسیله روش ایمونوفلورسانس غیر مستقیم ارزیابی کیفی آنتی ژن و بررسی فعالیت بیولوژیکی پروتیین نوترکیب NA انجام شد. پس از آلوده سازی سلولهای Sf9 حشره ، پروتیین نوترکیب در سطح سلولهای مذکور بیان شده و با استفاده از آنتی سرم پلی کلونال خرگوش ایمن شده بر علیه ویروس آنفلوانزای سویه H1N1 ، رنگ سبز درخشان فلورسانس در میکروسکوپ مشاهده شد که نشانه بیان پروتیین نورآمینیداز در سطح سلولهای Sf9 بود . یافته های حاصل از مطالعه نشان داد که پروتیین نورآمینیداز قابلیت بیان در سطح سلول را داشته و فعالیت بیولوژیک دارد. بدیهی است بایستی فعالیت ایمنولوژیک و توانمندی آن بعنوان یک واکسن فرضی در مدل حیوانی در تحقیق آینده بررسی شود