بیان ژن پروتیین پوششی ویروس برگ قاشقی سیب زمینی در باکتری Escherichia coli و تولید آنتی بادی چند همسانه ای اختصاصی بر علیه ویروس

یکی از مهمترین روش های تشخیص ویروس های بیماری زا، کاربرد روش های سرولوژیکی مبتنی بر الایزا با استفاده از آنتی بادی های اختصاصی است. از روش های جدید برای تهیه آنتی بادی های اختصاصی که با پیشرفت تکنولوژی دی ان آ نوترکیب حاصل شده است، بیان پروتیین مورد نظر در برخی از باکتری ها از جمله باکتری Escherichia coli و تزریق آن به حیوان خونگرم است. ویروس (Potato leafroll virus, PLRV) از نظر اقتصادی از مهمترین ویروس های سیب زمینی بوده و حضور یا عدم حضور آن در اکثر طبقات بذری این محصول حایز اهمیت است. به منظور تهیه آنتی بادی نوترکیب علیه این ویروس ابتدا جدایه های این ویروس از مزارع تولید بذر سیب زمینی در استان های اردبیل، همدان، آذربایجان شرقی، کردستان، اصفهان، مرکزی و خراسان رضوی جمع آوری شد. آلودگی تعدادی از نمونه ها به PLRV با آزمون های الایزا و استفاده از آنتی بادی اختصاصی ویروس تایید شد. دو جفت آغاز گر اختصاصی برای تکثیر قطعه 1067 نوکلیوتیدی حاوی قطعه 627 نوکلیوتیدی ناحیه ژنومی مربوط به پروتیین پوششی ویروس بر اساس توالی های ثبت شده آن از نقاط مختلف دنیا از جمله آسیا، اروپا و کانادا و با استفاده از نرم افزارهای آنلاین ClustalW و Primer3 طراحی شد. قطعه مورد نظر از تعداد شش، چهار و یک جدایه به ترتیب از استان های همدان، اردبیل و آذربایجان شرقی تکثیر و توالی یابی شد. پس از مقایسه توالی های بدست آمده، توالی غالب در بین جدایه ها، جدایه ای از استان اردبیل، انتخاب و در ناقل pTG-19T (شرکت سیناکلون) همسانه سازی شد. صحت همسانه نوترکیب حاصل (pTG-PLRV-CP) از طریق تعیین ترادف ژن وارد شده مورد تایید قرار گرفت. برای بیان توالی مذکور از ناقل بیان pET28 دارای دنباله هیستیدین در ناحیه 5' استفاده شد. قطعه مورد نظر ابتدا با آغازگرهای اختصاصی دارای سایت های برشی HindIII و KpnI به ترتیب در انتهای 5' آغازگرهای مستقیم و معکوس تکثیر و سپس با همین آنزیم ها هضم شد. قطعه هضم شده در ناقل بیان هضم شده با این آنزیم ها وارد شد. پلاسمید نوترکیب بدست آمده (pET-PLRV-CP) به باکتری E. coli سویه ی DE3 منتقل گردید. در نهایت بیان پروتیین پوششی با استفاده از ماده القاکننده IPTG در باکتری القا شد. استخراج پروتیین پوششی بیان شده با استفاده از رزین Ni-NTA انجام شد. آزمون لکه گذاری وسترن با استفاده از آنتی بادی anti-His از بیان باند حدود 28 کیلودالتونی مربوط به پروتیین پوششی PLRV (بعلاوه شش اسید آمینه هیستیدین) حکایت داشت. پروتیین بیان شده برای تهیه آنتی بادی چند همسانه ای در خرگوش سفید نیوزیلندی تزریق و یکماه بعد آنتی بادی از خون خرگوش به روش دیالیز استحصال شد. برای تهیه آنتی بادی IgG-AP، آنتی بادی به آنزیم آلکالین فسفاتاز الحاق شد. آنتی بادی های حاصل از توان بالایی در ردیابی ویروس از نمونه های آلوده به PLRV در آزمون ELISA برخوردار بودند. واژه های کلیدیبیان پروتیین، پروتیین پوششی، باکتری E. coli، ویروس PLRV، آنتی بادی چند همسانه ای