تشخیص مولکولی و تعیین توالی اسیدهای آمینه ناحیه شکافتگی هماگلوتینین در ویروس آنلفوانزای جدا شده از طیور گوشتی اسنان خراسان شمالی

بیماری آنفلوانزای پرندگان یکی از بیماری های ویروسی مهم در مرغداری های صنعتی کشور می باشد و هر سال خسارات عمده ای به صنعت پرورش طیور کشور وارد می کند. تشخیص سریع ویروس آنفلوانزا و تعیین حدت آنها یکی از اولویت های مهم پیگیری و مبارزه علیه این بیماری در کشور محسوب می شود. از آزمایش RT-PCR جهت تشخیص ویروس های آنفلوانزا و نیز بررسی توالی محل شکافتگی پروتیین هماگلوتینین (HA) به عنوان یک شاخص مولکولی به منظور پیش بینی حدت سویه های آنفلوانزا مورد استفاده قرار گرفت. در این تحقیق جهت پایش بیماری آنفلوانزا 160 نمونه سوآپ نای از 20 واحد پرورش مرغ گوشتی در استان خ راسان شمالی که مشکوک به بیماری آنفلوانزا بودند اخذ گردید. آزمایش مولکولی RT-PCR بر اساس ژنوتیپ های شایع در ایران پایه ریزی ردید که در آن برای تعیین تیپ گروه A آنفلوانزا از پرایمر اختصاصی ژن ماتریکس (M) و جهت تعیین تحت تیپ های (H(9)- H(5)- H(7 از پرایمرهای اختصاصی ژن هماگلوتنین (HA) استفاده شد. جهت تعیین توالی، نمونه های مثبت شده از نظر تیپ A به تخم مرغ جنین دار (SPF) 9-11 روزه تزریق شد، پس از سه تا پنج روز مایع آلانتوییک با استفاده از فرمالین 1 درصد خ نثی و جهت بررسی تست هماگلوتیناسیون و استخراج RNA ی ویروسی استفاده گردید. سپس قطعه ای به طول 437 bp در برگیرنده محل شافتگی ژن هماگلوتینین تکثیر و جهت تعیین توالی نوکلیوتیدی به شرکت MWG آلمان ارسال شد و در نهایت به توالی اسید آمینه ای ترجمه گردید. نتایج نشان داد که با استفاده از روش RT-PCR نمونه های اخذ شده از 4 مرغداری صنعتی از نظر ویروس تیپ A آنفلوانزا مثبت بودند. تمام ویروس های تیپ A از نظر تحت تیپ (H(7), H(5 منفی و از لحاظ (H(9 مثبت تشخیص داده شدند. بررسی محل شکافتگی پروتیین هماگلوتینین نشان داد که هر 4 سویه دارای توالی KSSR بودند، اگرچه این توالی نشان دهنده غیرحاد بودن سویه ها می باشد ولی با الگوی جدایه های قبلی ایران که عمدتا RSSR می باشد تفاوت داشت. به طور کلی آزمایش RT-PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی تحت تیپ های رایج در منطقه، تشخیص تفریقی سریع ویروس های آنفلوانزا را امکان پذیر می سازد. تغییر در محل شکافت پروتیین هماگلوتینین در ویروس های (H(9)N(2 را می توان به عنوان یک خطر بالقوه جهت تبدیل این ویروس ها به سویه های حاد در نظر گرفت. لذا پایش مستمر توالی ژنتیکی این ویروس ها توصیه می گردد.

کلیدواژه ها:

آنفلوانزای پرندگان ، RT-PCR ، تحت تیپ (H(9)- H(5)- H(7 ، محل شافتگی پروتیین هماگلوتینن ، خراسان شمالی