بیان و تخلیص پروتئین کایمر نوترکیب دربردارنده نواحی ایمونوژنیک فاکتورهای بیماری زای اینتیمین و فلاژلین H۷ از باکتری Escherichia coli O۱۵۷:H۷

اشریشیا کلی انتروهموراژیک O۱۵۷:H۷ یکی از پاتوژن های مهم منتقله از غذا است که چسبندگی آن به اپیتلیوم روده و کلونیزاسیون اولیه، با عواملی مانند اینتیمین و فلاژلین H۷ ارتباط دارد. هدف این مطالعه، تولید، شناسایی و خالص سازی پروتئین کایمر نوترکیب IH۷، متشکل از نواحی ایمونوژنیک اینتیمین و فلاژلین H۷، به منظور دستیابی به آنتی ژنی مناسب برای مطالعات ایمنی شناختی بود. سازه سنتزی IH۷ شامل ۲۶۷ اسیدآمینه از بخش H۷ در انتهای N، لینکر سخت (EAAAK)۲، تعداد ۱۸۸ اسیدآمینه از اینتیمین در انتهای C و دنباله شش تایی هیستیدین بود و در وکتور (+)pET۲۸a قرار گرفت. پلاسمید نوترکیب به Escherichia coli BL۲۱(DE۳) منتقل و کلنی های مقاوم به کانامایسین انتخاب شدند. حضور سازه با PCR و مشاهده محصولی در حدود ۱۵۹۲ جفت باز تایید شد. بیان پروتئین با یک میلی مولار IPTG، در ۳۷ درجه سانتی گراد و به مدت پنج ساعت القا گردید. آنالیز SDS-PAGE باند شاخصی در محدوده تقریبی ۷۰ کیلودالتون نشان داد. بررسی حلالیت مشخص کرد که بخش عمده پروتئین در فاز نامحلول قرار دارد؛ ازاین رو، استخراج با اوره ۸ مولار و خالص سازی دناتوره بر ستون Ni-NTA انجام شد. پروتئین هدف عمدتا در فراکشن های واجذب با ایمیدازول ۲۵۰ میلی مولار بازیابی شد. واکنش اختصاصی باند ۷۰ کیلودالتونی با آنتی بادی ضد His-tag در وسترن بلات، هویت پروتئین را تایید کرد. در مجموع، سامانه pET۲۸a(+)/BL۲۱(DE۳) امکان تولید قابل تشخیص IH۷ را فراهم کرد و تخلیص دناتوره همراه با دیالیز، آنتی ژن مورد نیاز برای مراحل بعدی ایمن سازی را در اختیار قرار داد.

کلیدواژه ها:

اشریشیا کلیO۱۵۷:H۷ ، پروتئین کایمر IH۷ ، اینتیمین ، فلاژلین H۷ ، بیان نوترکیب