تهیه و استانداردسازی آنتی توکسین بتاکلستریدیوم پرفرینجنس تایپ C

باکتری کلستریدیوم پرفرنجنس تیپ ‭C ‬در بره ها، گوساله ها، کره اسبها، بچه خوکها و جوجه ها باعث ایجاد بیماری انتروتوکسمی می شود. همچنین در انسان، عامل بیماری ‭enteritis necroticans ‬یا ‭pigbel ‬می باشد. مهمترین توکسین تیپ ‭C ‬توکسین بتا است. این توکسین مهمترین فاکتور ویرولانس باکتری کلستریدیوم پر فرنجنس تیپ ‭C ‬در بیماریزایی این جرم می باشد. تهیه و استاندارد سازی آنتی توکسین جهت آزمایشات ‭potency ‬و ‭efficacy ‬واکسن های توکسوییدی دارای اهمیت بالایی می باشد. با توجه به تولید واکسن انتروتوکسمی در بخش تولید و تحقیق واکسن های باکتریایی بیهوازی و لزوم انجام آزمایشات مربوط به این واکسن، تهیه و استانداردسازی آنتی توکسین های مربوط به این واکسن اجتناب ناپذیر است. بنابراین در این تحقیق تولید آنتی توکسین بتا متعاقب ایمنیزاسیون گوسفند با توکسین بتا انجام شد و نهایتا خالص سازی گردید. پس از کشت باکتریایی، ‭MLD ‬نمونه حاصل از کشت باعث مرگ موشها تا رقت ‮‭1/2000‬ شد. همچنین نمونه کشت اولیه باعث مرگ سلولهای ‭HUVEC ‬در کشت سلولی شد. در ابتدا جهت خالص سازی توکسین بتا، پس از عملیات ترسیب، تغلیظ و دیالیز، نمونه خام بر روی ستون کروماتوگرافی تعویض کاتیونی ‭CM-Sepharose ‬بارگذاری شد و اولین فراکسیون حاصل جهت تزریق به حیوانات استفاده شد. نتایج وسترن بلات دلالت بر وجود توکسین بتای فعال در فراکسیون به دست آمده داشت. جهت ایمن سازی حیوانات، در تزریق اول توکسویید با ادجوانت کامل فروند به شکل زیر جلدی به گوسفندان تزریق شد. در تزریق های یادآور، توکسویید با ادجوانت ناقص فروند به حیوانات با فواصل زمانی مشخص تزریق شد. در پایان تزریقات از حیوانات خونگیری شد و تیتر آنتی بادی تولید شده با استفاده از ‭serum neutralization test ‬اندازه گیری شد. برای تهیه ایمونوگلوبولینها از سرم گوسفند و حذف برخی ناخالصیها، محلول پروتیینی با سولفات آمونیوم ‮‭40‬ % رسوب داده شد. برای تخلیص ‭Ig G ‬از تکنیک کروماتوگرافی تعویض آنیون ‭DEAE- Cellulose ‬استفاده شد. پس از انجام الکتروفورز فراکسیون نهایی حاصل از کروماتوگرافی تعویض آنیونی، باند مربوط به ایمونوگلوبولین ‭G ‬که حدود ‮‭47‬ کیلو دالتون می باشد مشاهده گردید. . تیتر آنتی توکسین به دست آمده ‭IU/ml ‬‮‭500‬، ‭IU/ml‬‮‭1500‬ و ‮‭250‬ ‭IU/ml ‬به ترتیب برای آنتی توکسین بتای خام، آنتی توکسین بتای تغلیظ شده و آنتی توکسین بتای خالص شده تعیین شد.