شناسایی ویژگی های ژنی پروتئین مهار کننده آنزیم پلی گالاکتوروناز لوبیا با استفاده از Mismatch primers، Multiplex PCR و کلونینگ

در دیواره سلولی اغلب دو لپه ایها از جمله لوبیا گلیکوپروتیئنهای مهاری آنزیم پلی گالاکتوروناز (Polygalacturonase-inhibiting proteins/PGIP) وجود دارد که قادرند طیف وسیعی از آنزیم های پلی گالاکتوروناز (Polygalacturonase/PG) قارچی را تشخیص و مهار کنند. جهت مطالعه تنوع ژنی pgip، بعد از استخراج DNA ژنومی از برگ های لوبیا به روش CTAB، تکثیر ژنpgip1 با استفاده از پرایمرهایRB1/RB2 و ژن pgip2 با استفاده از پرایمرهای 2RB21/2RB11 صورت گرفت. از الگوی تکثیر محصول PCR با پرایمرهای ناحیه میکروساتلیتی و همچنین الگوی هضم آنزیمی برای شناسایی ژن pgip1 استفاده شد اما برای شناسایی و تفکیک ژن pgip2 محصول PCRحاصل به عنوان الگو برای تکثیر با استفاده از Mismatch پرایمرهای داخل ژنی بصورت Multiplex PCR انجام گرفت. محصولPfu تکثیر شده پس از هضم آنزیمی، در سایت XbaI/SacI وکتور pUC18 کلون شد. پلاسمیدهای نوترکیب پس از تایید با الگوی هضم آنزیمی در دو جهت تعیین توالی گردیدند. نتایج نشان داد که ژن pgip2این واریته علاوه بر اینکه فاقد 27 نوکلئوتید در انتهای5´ می باشد دارای 25 اختلاف نوکلئوتیدی در ORF (Open reading frame) در مقایسه با توالی ژن pgip1 نیز است که در سطح توالی اسید آمینه ای 12 اختلاف نوکئوتیدی منجر به تغییر 11 اسید آمینه شده اند و مابقی تغییر آمینو اسیدی را سبب نشد.