بررسی شبکه ژن ها و ‎miRNAهای تنظیم کننده در پاتوژنز ورم پستان گاو ناشی از Escherichia coli به کمک تحلیل بیان‎ ژنی ریزآرای ه‎ای

چکیده مبسوط مقدمه و هدف: ورم پستان گاو یکی از شایع ترین و پر هزینه ترین بیماری های عفونی در صنعت جهانی دام است و سالانه موجب خسارات اقتصادی قابل توجهی از طریق کاهش تولید شیر، افت کیفیت ترکیبات شیر، افزایش هزینه های درمان، حذف زود هنگام دام و افزایش بار آنتی بیوتیکی می‎شود. این بیماری با پاسخ های التهابی شدید در غده ‎پستانی همراه است که ناشی از تعامل پیچیده بین پاتوژن، سیستم ایمنی‎ ذاتی و اکتسابی میزبان و تنظیم ژنتیکی و فراژنتیکی مسیرهای مولکولی متعدد است. در میان عوامل بیماری زا، اشرشیا کلی (E. coli) یکی از مهم ترین باکتری های مولد ورم پستان حاد است که با تحریک سریع مسیرهای التهابی، موجب تخریب بافتی و تغییرات گسترده در پروفایل بیان ژن می شود. پیشرفت فناوری های امیکس، به ‎ ویژه ریز آرایه ها (Microarray) و RNA‑seq، نشان داده ‎است که ورم پستان سبب تغییر بیان در هزاران ژن مرتبط با ایمنی‎ذاتی، پاسخ التهابی، متابولیسم انرژی، چرخه‎ سلولی و بازسازی بافت پستان می شود. با این‎حال، بسیاری از مطالعات پیشین عمدتا بر شناسایی ژن های متفاوت بیان تمرکز داشته اند و تحلیل ساختار شبکه ای ژن ها و نقش تنظیمی miRNAها که به ‎عنوان تنظیم کننده های پسارونویسی شناخته می شوند، به صورت یکپارچه مورد بررسی قرار نگرفته‎ است. miRNAها با اتصال به mRNAهای هدف، قادرند به طور همزمان چندین مسیر سیگنال‎ دهی ایمنی و متابولیک را تنظیم کنند و بدین‎ ترتیب نقش کلیدی در تعیین شدت التهاب، تداوم پاسخ ایمنی و پیامدهای بافتی بیماری ایفا نمایند. از این‎‎ رو، هدف اصلی پژوهش حاضر، شناسایی ژن های هاب و miRNAهای کلیدی مرتبط با پاتوژنز ورم پستان القا شده توسط E. coli در گاو شیری و بررسی نقش آن ها در تنظیم شبکه ای مسیرهای ایمنی، التهابی و متابولیکی با استفاده از یک رویکرد بیوانفورماتیکی مبتنی ‎بر شبکه است. مواد و روش ها: در این مطالعه، پروفایل بیان ژنی مربوط به نمونه‎ های بافت غد‎ه ‎پستانی گاو مبتلا به ورم پستان ناشی از E. coli از پایگاه داده Gene Expression Omnibus (GEO) تحت شناسه GSE۱۵۰۲۰ استخراج گردید. تحلیل بیان ژن های متفاوت بیان با استفاده از ابزار GEO۲R انجام شد و ژن ها بر اساس معیارهای آماری P-value < ۰.۰۵ و (|LogFC|>۱) فیلتر شدند تا ژن های دارای تغییر بیان معنی دار شناسایی گردند. به منظور بررسی تعاملات مولکولی، شبکه برهم کنش پروتئین ‎پروتئین (PPI) با استفاده از پایگاه داده STRING ساخته ‎شد و سپس در محیط نرم افزار Cytoscape مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. شناسایی ژن های هاب شبکه با بهره گیری از افزونه cytoHubba و به کارگیری الگوریتم های Degree، MCC، MNC و DMNC انجام شد تا ژن هایی که بالاترین اهمیت توپولوژیک و نقش مرکزی را در شبکه دارند، استخراج گردند. در ادامه، برای پیش بینی miRNAهای تنظیم کننده ژن های هاب، پایگاه داده miRWalk مورد استفاده قرار گرفت و miRNAهایی که به طور مشترک چندین ژن کلیدی را هدف قرار می دادند، انتخاب شدند. این رویکرد امکان ترسیم تعاملات ژن miRNA و تفسیر نقش تنظیمی آن ها در مسیرهای سیگنالینگ مرتبط با ورم پستان را فراهم نمود. یافته ها: نتایج تحلیل بیان متفاوت ژن ها منجربه شناسایی ۱۰۲۳ ژن با تغییر بیان معنی دار شدند که از این میان ۶۱۲ ژن افزایش بیان و ۴۱۱ ژن کاهش بیان را نشان دادند. تحلیل شبکه PPI ده ژن هاب شامل GAPDH، ALB، CXCL۸، IL۱B، CCL۲، EGFR، PTPRC، PARP۱۲، IFITM۳ و XAF۱ را به‎ عنوان اجزای مرکزی شبکه معرفی کرد. این ژن ها عمدتا در مسیرهای کلیدی التهاب، سیگنالینگ کیموکاین ها، پاسخ ایمنی‎ ذاتی، تنظیم چرخه‎ سلولی و بقایای مرگ سلولی دخیل هستند. برای نمونه، IL۱B یکی از کلیدی ترین میانجی های تب و التهاب است و به‎‎ عنوان یکی از مهم ترین سایتوکاین های پیش التهابی نقش اساسی در القای تب، نفوذپذیری عروقی و فعال سازی سلول های ایمنی ایفا می کند. CXCL۸ با تنظیم جذب و فعال سازی نوتروفیل ها، در پاسخ ایمنی اولیه علیه عفونت باکتریایی نقش تعیین کننده دارد. همچنین، ALB به‎ عنوان یکی از ژن های هاب شناسایی شد، که می تواند در قالب پروتئین های فاز حاد مثبت در شیر، به‎ عنوان یک نشانگر زیستی بالقوه برای تشخیص ورم پستان مورد توجه قرار گیرد. تحلیل miRNAها منجر به شناسایی ۴۵ miRNA مشترک شد که قادر به تنظیم همزمان چندین ژن هاب بودند. در میان آن ها، bta-miR-۲۱-۳p با هدف قراردادن EGFR و IL۱B و تنظیم مسیر PI۳K/AKT/NF‑κB نقش مهمی در تشدید پاسخ التهابی دارد. bta-miR-۱۴۵ با مهار تکثیر سلول های اپی تلیال پستانی (Mac‑T) و تنظیم IL۱B می تواند در تعادل بین التهاب و بازسازی بافت نقش ایفا کند. همچنین،  bta-miR-۱۳۸از طریق مهار مسیر p۶۵/NF‑κB، بیان ژن های PARP۱۲ و EGFR را تحت ‎تاثیر قرار می‎ دهد و در تنظیم پاسخ ایمنی ضد ویروسی و التهابی مشارکت دارد. این یافته ها نشان می دهند که miRNAها قادرند به صورت هماهنگ مسیرهای التهابی را فعال و مسیرهای متابولیکی مرتبط با عملکرد طبیعی غده ‎پستانی را سرکوب نمایند. نتیجه گیری: ورم پستان گاو یک فنوتیپ پیچیده، چند عاملی و شبکه محور است که حساسیت یا مقاومت دام به آن حاصل برهم کنش دینامیک ژن ها، miRNAها و مسیرهای مولکولی متعدد است. نتایج این مطالعه با بهره گیری از یک رویکرد بیوانفورماتیکی یکپارچه، ژن ها و miRNAهای کلیدی دخیل در پاتوژنز ورم پستان ناشی از E. coli را شناسایی نمودند و نقش محوری مسیرهای ایمنی نظیر JAK/STAT، سیگنالینگ اینترفرون، NF‑Κb و همچنین مسیرهای متابولیکی و میتوکندریایی تحت تنظیم EGFR را برجسته ساختند. یافته های حاضر می توانند به‎ عنوان مبنایی برای توسعه نشانگرهای مولکولی تشخیصی، طراحی ابزارهای پیش آگهی، و برنامه های اصلاح ‎نژادی مبتنی‎ بر مقاومت به ورم پستان در گاوهای شیری مورد استفاده قرار گیرند و درک عمیق تری از سازوکارهای مولکولی این بیماری شایع فراهم سازند.

کلیدواژه ها:

Gene expression profiling ، Gene network ، microRNA ، Mastitis ، پروفایل بیان ژنی ، شبکه ژنی ، میکرو آران ای ، ورم پستان