تحلیل یکپارچه شبکه ی تنظیمی miRNA-ژن در بافت های مغز و ریه مرغ در طول عفونت آنفلوانزای پرندگان H۵N۳

چکیده مبسوط مقدمه و هدف: برخلاف تمرکز عمده پژوهش ها بر سویه های پاتوژن بالای آنفلوانزای پرندگان نظیر H۵N۱ و H۵N۸، زیرگروه H۵N۳ به ‎دلیل ویژگی های منحصر به فرد، از جمله پتانسیل بالای سازگاری، پاتوژنیسیته متوسط تا شدید در میزبان های پرنده و خطر بالقوه عبور از سد گونه ای، یک اولویت پژوهشی محسوب می شود. از این‎ رو، تحلیل بیماری زایی این ویروس بدون بررسی جامع بافت های حیاتی چون ریه (محل تکثیر اولیه) و مغز (هدف تهاجم نوروتروپیک) ناقص خواهد بود. ریه ها و مغز دو بافت حیاتی در بررسی پاتوژنز آنفلوانزا هستند. ریه ها به‎ عنوان محل اصلی ورود ویروس و فعال‎ شدن ایمنی ذاتی عمل می کنند، در حالی ‎که گسترش ویروس به مغز نشان ‎دهنده انتشار سیستمیک و نوروتروپیسم است که منجربه پیامدهای شدیدی مانند اختلالات عصبی، فلج و مرگ ناگهانی در طیور می شود. در‎ حالی‎ که تحقیقات گسترده ای در مورد پاتوژنز آنفلوانزای مرغی در سطوح هیستوپاتولوژیک و ایمونولوژیک انجام شده ‎اند، تحقیقات مبتنی ‎بر داده های مولکولی با توان عملیاتی بالا، مانند ترانسکریپتومیکس، در طیور، به‎ ویژه در زمینه های تحقیقاتی ایران، نسبتا محدود هستند. شناسایی ژن های کلیدی مرکزی و عناصر تنظیمی غیر کدکننده، مانند میکرو RNAها (miRNAها)، بینش مهمی را در مورد چگونگی سازماندهی مجدد چشم انداز مولکولی میزبان هنگام مواجهه با یک عامل بیماری زا ارائه می دهد. در این زمینه، مطالعه حاضر با هدف ساخت شبکه ی تنظیمی ژن بر اساس پروفایل های بیان ژن افتراقی از بافت های مغز و ریه جوجه های آلوده به دو سویه ویروس نوترکیب H۵N۳، یعنی rH۵N۳ Ori و rH۵N۳ P۶، انجام شد. با به کارگیری رویکردهای پیشرفته بیوانفورماتیک، ما به ‎دنبال شناسایی ژن های کلیدی، miRNAهای تنظیمی و مسیرهای بیولوژیکی بودیم که نقش های محوری در مکانیسم های دفاعی میزبان و پیشرفت بیماری ایفا می کنند. مواد و روش‎ها: بازیابی و تجزیه ‎و ‎تحلیل داده ها با دریافت داده های ریزآرایه DNA از پایگاه داده عمومی (GEO) و با شماره دسترسی GSE۹۶۸۳۷ آغاز شد، که شامل پروفایل های رونویسی از بافت های مغز و ریه مرغ هایی بود که به ‎صورت تجربی با ویروس H۵N۳ آلوده شده بودند و به همراه آن، نمونه های شاهد از پرندگان غیر آلوده به‎ عنوان پایه استفاده شدند. پیش پردازش و نرمال سازی داده ها در R با استفاده از بسته limma انجام شد و بیان افتراقی ژن از طریق آزمون t تعدیل شده تعیین شد و ژن هایی با مقدار p تعدیل شده کمتر از ۰/۰۵ و تغییر مطلق لگاریتمی ۲ بزرگ‎ تر از ۱ به ‎عنوان معنی دار در نظر گرفته شدند. تغییرات رونویسی سراسری با استفاده از نمودارهای آتشفشانی و نقشه های حرارتی تجسم شدند. برای بررسی شبکه های برهمکنش پروتئین-پروتئین (PPI)، ژن های با بیان متفاوت (DEGs) با آستانه اطمینان بالای ۰/۷ در پایگاه داده‎ای SRTING (نسخه ۱۱/۵) بارگذاری شدند و شبکه های حاصل برای تجسم بهCytoscape  (نسخه ۳/۹) منتقل شدند. سپس ژن های هاب بر اساس توپولوژی شبکه و معیارهایی مانند مرکزیت درجه و مرکزیت بینابینی شناسایی شدند. برای تفسیر عملکردی، آنالیزهای غنی سازی با استفاده از g:Profiler و KEGG، با تاکید بر مسیرهای مرتبط با ایمنی، سنتز پروتئین و کنترل کیفیت RNA انجام شدند. یافته‎ها: مشاهده شد که بیماری با هر دو سویه rH۵N۳ Ori و rH۵N۳ P۶ باعث برنامه ریزی مجدد قابل‎ توجهی در بیان ژن میزبان در بافت های مورد بررسی شد. ریه ها پاسخ ایمنی شدیدتری نشان دادند، در حالی ‎که مغز تغییرات گسترده تری را در مسیرهای متابولیکی و شبکه های تنش عصبی نشان داد. در مجموع، ۱۴۸۰ DEGs در ریه ها در مقایسه با ۹۳۶ ژن در مغز شناسایی شدند که تفاوت های مختص بافتی قابل ‎توجه در پاسخ میزبان را برجسته می کند. تجزیه ‎و ‎تحلیل بیشتر شبکه، ۱۸ ژن هاب با اتصال بالا در شبکه های برهمکنش پروتئین-پروتئین (PPI) را شناسایی کرد. نکته قابل ‎توجه این است که اکثر این ژن های هاب، پروتئین های ریبوزومی، از جمله RPL۲۱، RPL۳۱ و RPS۲۸ بودند که نشان می دهد بیماری آنفلوانزا به‎ شدت بر دستگاه ترجمه میزبان تاثیر می گذارد. اجزای هاب اضافی مانند EEF۱A۱ و EIF۳F، که بازیگران کلیدی در طویل شدن و شروع ترجمه هستند، این ایده را تقویت کردند که اختلال در مسیرهای سنتز پروتئین برای بقا و تکثیر ویروس ضروری است. تجزیه ‎و‎ تحلیل غنی سازی با استفاده از مسیرهای KEGG، پنج مسیر مولکولی اصلی تحت ‎تاثیر بیماری را برجسته کرد: بیوژنز ریبوزوم و هیدرولیز GTP، هدف قرار دادن پروتئین موجود بر غشاها، تجزیه mRNA به ‎واسطه جهش بی معنی (NMD)، پیام‎رسانی ایمنی ذاتی (به‎ویژه پاسخ اینترفرون) و تنظیم آپوپتوز. در بافت های ریه، در طی غنی سازی فرآیندهای مرتبط با ایمنی مانند پیام‎رسانی گیرنده شبه RIG-I و تعاملات واسطه گری شده با سیتوکین غالب بود، در حالی‎ که مغز تغییرات قوی تری را در سطوح کنترل کیفی RNA، فعالیت میتوکندری و تنظیم مرگ خودخواسته سلول نشان داد که نشان دهنده پاسخ های تنش نورودژنراتیو در مغز است. در سطح بافت، DEGهای ریه مانند IFIT۵ و MX۱ مطابق با دفاع ضد ویروسی تحریک شده با اینترفرون، افزایش بیان زیادی را نشان دادند، در حالی‎ که کاهش بیان ژن ریبوزومی در بافت مغزی نشان داده شد که خود ممکن است به‎ عنوان یک سازوکار محافظتی برای محدودکردن تولید پروتئین ویروسی عمل کند. نتیجه گیری: تحلیل شبکه، ژن های پروتئین ریبوزومی را به‎ عنوان تنظیم کننده های مرکزی نشان داد و نقش دستگاه ترجمه میزبان، به‎ عنوان هدف کلیدی تداخل و دستکاری ویروسی در طول بیماری را برجسته کرد. علاوه ‎بر این، شناسایی miRNAهای جدید مرتبط با عفونت H۵N۳ فرصت های امیدوارکننده ای را برای توسعه نشانگرهای زیستی تشخیصی و درمان های ضد ویروسی بالقوه فراهم می کند. این یافته ها بر ضرورت بررسی بافت های گوناگون در پژوهش های مربوط به بیماری تاکید می کنند، زیرا تمرکز صرف بر یک اندام ممکن است درک ناقصی از پیشرفت بیماری و تعاملات میزبان-پاتوژن ارائه دهد. این پژوهش با به کارگیری پلتفرم های بیوانفورماتیک یکپارچه مانند STRING، Cytoscape و تجزیه ‎و‎ تحلیل مسیر KEGG، چارچوبی را ایجاد نمود که می تواند به سایر عفونت های ویروسی در طیور تعمیم داده شود. نکته مهم این است که بینش های به دست آمده در اینجا می‎توانند به ‎طور ویژه‎ای در هدایت راهبرد های بهبود ژنتیکی، با هدف تولید پرندگانی با مقاومت بیشتر در برابر بیماری، ارزش عملی داشته باشند. مسیرهای آینده باید شامل اعتبارسنجی تجربی ژن های هاب شناسایی شده و miRNAها از طریق تکنیک هایی مانند qRT-PCR و خاموش سازی ژن عملکردی، و همچنین ادغام تجزیه‎ و ‎تحلیل های پروتئومیکس و متابولومیکس با ترانسکریپتومیکس برای دستیابی به درک جامع تری از دینامیک میزبان-ویروس باشند. در نهایت، این مطالعه دانش ارزشمندی را در جهت محافظت از سلامت طیور و تقویت امنیت غذایی در مواجهه با تهدیدات مداوم آنفلوانزای مرغی ارائه می دهد.

کلیدواژه ها:

Gene networks ، Gene expression ، H۵N۳ influenza ، miRNA ، Ribosomal proteins ، Host-pathogen interactions ، آنفلوانزای H۵N۳ ، بیان ژنی ، پروتئین های ریبوزومی ، تعاملات میزبان-پاتوژن ، شبکه های ژنی ، miRNA