بهینه سازی شرایط تخلیص و بازآرایی پروتئین نوترکیب اندونوکلئاز محدودکننده EcoRI در E.coli
محل انتشار: فصلنامه بیوتکنولوژی کشاورزی، دوره: 17، شماره: 2
سال انتشار: 1404
نوع سند: مقاله ژورنالی
زبان: فارسی
مشاهده: 92
فایل این مقاله در 26 صفحه با فرمت PDF قابل دریافت می باشد
- صدور گواهی نمایه سازی
- من نویسنده این مقاله هستم
استخراج به نرم افزارهای پژوهشی:
شناسه ملی سند علمی:
JR_JOAGK-17-2_005
تاریخ نمایه سازی: 6 خرداد 1404
چکیده مقاله:
هدف: اندونوکلئازهای محدودکننده نوع دوم، متداول ترین نوع آنزیم های محدودکننده هستند که کاربرد وسیعی در مهندسی ژنتیک به ویژه همسانه سازی ژن ها دارند. آنزیم EcoRI از پرمصرف ترین آنزیم های محدودکننده نوع دو در حوزه مولکولی است. روش مرسوم تولید این آنزیم ها استفاده از سویه های تغییریافته باکتری Escherichia coli است که به منظور بیش تولید آنزیم EcoRI جهش یافته اند. خالص سازی آنزیم های تولید شده با این روش به ستون های متعدد کروماتوگرافی نیاز دارد که هزینه بر و وقت گیر است. باتوجه به اینکه آنزیم EcoRI دارای ساختاری ساده و بدون پل های دی سولفید و به صورت مونومر است در این مطالعه تولید آنزیم به روش نوترکیب، روش بهینه خالص سازی و بازآرایی این آنزیم مورد بررسی قرار گرفت.مواد و روش:ژن EcoRI از باکتری اشرشیا کولای (E. coli RY۱۳) جداسازی گردید و به منظور بیان ژن به صورت نوترکیب، در حامل بیانی pET۲۸ همسانه سازی و در باکتری E. coli BL۲۱ (DE۳) بیان شد. شرایط بهینه بیان پروتئین باتوجه به نوع القاگر، غلظت و دما پس از القا مورد بررسی قرار گرفت. بیان پروتئین به صورت محلول یا اجسام انکلوزیونی با استفاده از ژل SDS-PAGE بررسی شد. خالص سازی و بازآرایی پروتئین نوترکیب با دو روش کروماتوگرافی تمایلی و دیالیز انجام شد. فعالیت آنزیم در مقایسه با آنزیم تجاری EcoRI شرکت ترمو بررسی شد.نتایج: شرایط بهینه بیان EcoRI در غلظت ۸/۰ میلی مولار IPTG، دمای ۲۸ درجه سانتی گراد تعیین شد. نتایج حاصل از بررسی پروتئین نوترکیب بیان شده روی ژل SDS-PAGE نشان داده است که پروتئین نوترکیب به شکل اجسام انکلوزیونی بیان گردید همچنین حل شدن اجسام انکلوزیونی تحت شرایط ملایم واسرشته سازی اوره ۳ مولار نشان داد که اجسام انکلوزیونی از نوع غیرکلاسیک است. نتایج حاصل از بازآرایی اجسام انکلوزیونی با استفاده از دیالیز و بر روی رزین Ni-NTA مشخص کرد که بازدهی بازآرایی بر روی رزین بیشتر از بازآرایی با استفاده از دیالیز است. واکنش هضم آنزیمی با آنزیم تولیدشده و آنزیم تجاری نشان داد که آنزیم نوترکیب خالص شده مشابه آنزیم تجاری قادر به برش DNA پلاسمیدی است. نتیجه گیری: بازآرایی اجسام انکلوزیونی بر روی ستون منجر به صرفه جویی در وقت و هزینه شده و کارایی بیشتری نسبت به روش دیالیز دارد.
کلیدواژه ها:
نویسندگان
کاملیا کتالانی
استادیار، پژوهشکده ژنتیک و زیست فناوری طبرستان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ساری، ایران.
الهام سلیمانی
دکتری، پژوهشکده ژنتیک و زیست فناوری طبرستان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ساری، ایران.
قربانعلی نعمت زاده
استاد، پژوهشکده ژنتیک و زیست فناوری طبرستان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ساری، ایران
مراجع و منابع این مقاله:
لیست زیر مراجع و منابع استفاده شده در این مقاله را نمایش می دهد. این مراجع به صورت کاملا ماشینی و بر اساس هوش مصنوعی استخراج شده اند و لذا ممکن است دارای اشکالاتی باشند که به مرور زمان دقت استخراج این محتوا افزایش می یابد. مراجعی که مقالات مربوط به آنها در سیویلیکا نمایه شده و پیدا شده اند، به خود مقاله لینک شده اند :
