اولین گزارش از وقوع سوختگی جوانه و سرشاخه درختان گلابی با عامل Phoma glomerata در ایران

طی بازدید­های انجام شده طی نیمه پایانی زمستان ۱۳۹۷ تا ابتدای بهار ۱۳۹۸ از باغات گلابی در استان مازندران، نشانه­هایی مشابه سوختگی در سرشاخه­ها و جوانه­های جانبی مشاهده شد. به منظور بررسی و شناسایی عامل بیماری، نمونه­های دارای علائم به آزمایشگاه منتقل گردید و پس از ضد­عفونی سطحی توسط الکل اتانول ۷۰% و محلول هیپوکلریت سدیم ۵/۰ درصد در تشتک­های پتری حاوی محیط کشت آب آگار (WA) و سیب­زمینی دکستروز آگار (PDA) همراه با ۵/۱ درصد آنتی­بیوتیک تتراسایکلین و استرپتومایسین کشت داده شد و در دمای ۲۵ درجه سلسیوس نگهداری گردید. پرگنه قارچ، ابتدا به رنگ کرم تا قهوه­ای روشن و سپس به رنگ سبز تیره تغییر رنگ یافت و پس از پنج روز پیکنیدیوم­های قارچ در محیط کشت ظاهر شدند. در نهایت خالص­سازی جدایه­های قارچی به روش نوک ریسه و تک اسپور انجام و جدایه­های خالص درتشتک­های حاوی محیط کشت PDA کشت داده شد. پیکنید­ها تیره رنگ و تقریبا صاف با گردن نسبتا بلند بوده و کنیدی­های آن اغلب تک سلولی و تقریبا تخم­مرغی شکل تا بیضوی و شفاف اما در توده اسپور تیره رنگ بودند. کلامیدوسپور­های آن نامنظم و در زنجیره­های منشعب و غیرمنشعب به صورت میانی و انتهایی تشکیل شدند. بر اساس خصوصیات ماکروسکوپی و میکروسکوپی قارچ در محیط کشت و طبق توصیف ارائه شده توسط منابع معتبر علمی (Boerema et al., ۲۰۰۴)، گونه Phoma glomerata شناسایی شد. آزمون های بیماری زایی بر روی ده نهال سالم یک ساله و شاخه­های فاقد بیماری انجام شد. سوسپانسیون حاوی اسپور­های ثانوی با غلظت (۱۰۶ × ۱ اسپور در میکرو­لیتر) روی آن­ها پاشیده شد. گیاهان شاهد تنها با آب مقطر سترون آغشته شدند و پس از قرار دادن در محفظه پلاستیکی در دو دامنه دمایی ۲ ±۱۵ و ۲± ۲۳ درجه سلسیوس و رطوبت نسبی ۹۰%، در گلخانه نگهداری شدند. پس از ده روز علایم بیماری شامل لکه­های زرد با حاشیه سوخته مشاهده شد که با علایم ارائه شده در منابع (Chuan and Chand, ۱۹۸۰) مطابقت داشت. گیاهان شاهد فاقد علائم مزبور بودند. به منظور تهیه توده میسلیومی جهت استخراج DNA ژنومی، از محیط غذایی PDB (Potato dextrose broth) استفاده شد. استخراج DNA به روش CTAB انجام گردید (Doyle and Doyle, ۱۹۸۷؛ امیردهی و همکاران، ۱۳۹۶). نواحی ژنومی ITS۱-۵.۸S-ITS۲ تکثیر و تعیین توالی شدند. جهت تکثیر این نواحی از ترکیب آغازگر ITS۱ با توالی )'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-۳'۵) به عنوان آغازگر مستقیم و آغازگر ITS۴ به عنوان آغازگر معکوس با توالی ('-TCCTCCGCTTATTGATATGC-۳'۵) استفاده شد (White and Morgan, ۱۹۸۷؛ White et al., ۱۹۹۰). مخلوط واکنش PCR با حجم نهایی ۲۵ میکرو­لیتر شامل ۵/۶ میکرو­لیتر آب دیونیزه استریل، ۵/۱۳ میکرو­لیتر ۲X PCR Master Mix ، ۵/۰ میکرو­لیتر از هر آغازگر به غلظت نهایی ۱۰ پیکومول و ۴ میکرو­لیتر DNA طی واکنش زنجیره ای پلی­مراز شامل واسرشت­سازی اولیه در دمای ۹۴ درجه سلسیوس به مدت دو دقیقه و سپس ۳۸ چرخه تحت           ۱- دانشجوی دکتری، گروه بیماری­شناسی گیاهی، دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران ۲- دانشیار، بخش تحقیقات گیاهپزشکی، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی مازندران، ساری، ایران نویسنده مسئول مکاتبات: [e-mail] شرایط واسرشت­سازی در ۹۴ درجه سلسیوس به مدت ۳۰ ثانیه، اتصال در دمای ۵۰ درجه سلسیوس ۳۰ ثانیه، گسترش در دمای ۷۲ درجه سلسیوس ۳۰ ثانیه و گسترش نهایی در دمای ۷۲ درجه سلسیوس به مدت ۱۰ دقیقه در دستگاه ترموسایکلر قرار گرفت و سپس محصول نهایی از طریق الکتروفورز در ژل آگارز ۲/۱ درصد ارزیابی شد (White et al., ۱۹۹۰). پس از تعیین توالی و همردیف­سازی با توالی­های موجود در بانک ژن GenBank (NCBI) توسط نرم­افزار BLAST مقایسه و شباهت جدایه­های مورد نظر با قارچ Phoma glomerata (Corda) Wollenw & Hochapfel در سطح ۹۹ درصد مشخص گردید. قارچ Phoma glomerataاولین بار از کشور هند به عنوان عامل بیماری در فیکوس گزارش گردید Mathur, ۱۹۷۹)). همچنین این قارچ با علائم سرخشکیدگی و سوختگی جوانه­های جانبی گلابی نیز برای اولین بار از هند گزارش شد (Chuan and Chand, ۱۹۸۰). در ایران نیز وجود این قارچ اولین بار بر روی گندم (صفایی و همکاران، ۱۳۷۹) گزارش گردید و پس از آن بر روی کدوئیان (حاتمی و همکاران، ۱۳۸۷)، فیکوس (آقاپور و همکاران، ۱۳۸۸)، نارنگی (رستمی و همکاران، ۱۳۹۲)، رزماری (Moshrefi Zarandi et al., ۲۰۱۵) در مناطق مختلف ایران گزارش شد. بنابراین این قارچ تاکنون در ایران بر روی درختان گلابی گزارش نشده است و این اولین گزارش از وقوع سوختگی جوانه و سرشاخه با عامل قارچی Phoma glomerataروی درختان گلابی (Pyrus communis) در ایران است.

کلیدواژه ها:

توالی نواحی ITS ، سوختگی سرشاخه ، Pyrus communis ، Phoma glomerata