شناسایی منابع مقاومت به شبه قارچ ‭Polymyxa betae ‬در جنس ‭Beta ‬با استفاده از روش سرولوژیکی الایزا

بیماری ریشه گنایی چغندرقند (ریزومانیا)، یکی از مهمترین بیماری های ویروسی در چغندرقند می باشد. ع ام ل این بیماری وی روس زردی نکروتیک رگب رگ چغندرقند است. پلاسمودیوفورویید ‭Polymyxa betae ‬در ریشه گیاهان آلوده به صورت پارازیت اجباری رشد می کند و به عنوان تنها ناقل طبیعی این ویروس شناخته شده است. تاکنون عمده رقم های مقاوم به بیماری ریزومانیا بر اساس مقاومت به عامل ویروسی تولید شده اند. با توجه به محدودیت منابع مقاومت بر علیه ویروس و همچنین قابلیت بالای ویروس ها در شکستن مقاومت ارقام مقاوم، شناسایی منابع مقاومت بر علیه شبه قارچ ناقل بیماری می تواند به عنوان یک جایگزین و یا مکمل در برنامه های اصلاحی جهت ارتقا مقاومت به بیماری ریزومانیا و کاهش خسارات حاصله مورد استفاده قرار گیرد. هدف از اجرای تحقیق حاضر، تولید سیستم های تشخیصی برای شبه قارچ ناقل و همچنین ارزیابی مقاومت ارقام بومی و تجاری چغندرقند به شبه قارچ مذکور می باشد. تا کنون عمده روش های شناسایی شبه قارچ ‭Polymyxa ‬در گیاهان آلوده مبتنی بر مشاهده مستقیم اسپورهای استراحتی درون بافت ریشه گیاه بوده است. انجام آزمون های کمی در شناسایی شبه قارچ فوق با استفاده از روش های مولکولی، از قبیل ‭Real time-PCR ‬انجام شده است که استفاده از این روش ها مستلزم امکانات آزمایشگاهی پیشرفته و همچنین صرف هزینه بالا می باشد. برای این منظور و جهت تسهیل در روند شناسایی شبه قارچ در گیاهان آلوده، در این پروژه ابتدا کیت تشخیصی سرولوژیک الیزا تولید شد. برای این منظور ابتدا آنتی بادی اختصاصی شبه قارچ با استفاده از آنتی ژن اختصاصی ‭Glutathion S-transferase (GST) ‬تولید گردید. تولید انبوه پروتیین ‭GST ‬نوترکیب در میزبان باکتریایی و خالص سازی آن با انجام روش کروماتوگرافی تمایلی و استفاده از ستون نیکل انجام گرفت. جهت تهیه آنتی بادی، تزریق آنتی ژن، پروتیین نوترکیب ‭GST‬، به خرگوش صورت پذیرفت و پس از رسیدن تیتر آنتی بادی اختصاصی به حدود ،‮‭100000‬ خونگیری و جدا سازی سرم خون انجام گرفت. خالص سازی آنتی بادی با استفاده از ستون کروماتوگرافی پروتیین ‭A ‬انجام گرفت و به منظور تهیه کانژوگه، اتصال آن به آنزیم آلکالین فسفاتاز صورت پذیرفت. در مراحل بعد قابلیت آنتی بادی های مذکور در شناسایی نمونه های نوترکیب و طبیعی آنتی ژن در آزمون سرولوژیکی ‭DAS-ELISA ‬مورد تایید قرار گرفت و از آن برای شناسایی شبه قارچ در نمونه های آلوده استفاده گردید. همچنین قابلیت شناسایی شبه قارچ با استفاده از روش های مشاهده میکروسکوپی و نانوبیوسنسور مبتنی بر ‭FRET ‬صورت پذیرفت. برای ارزیابی مقاومت چغندرقند به ‭P. betae ‬تعداد ‮‭60‬ ژنوتیپ چغندرقند در خاک آلوده کشت شدند. ارزیابی ژرم پلاسم چغندر با دو سیستم الایزا و نانوبیوسنسور بر اساس فراوانی بوته های مقاوم نشان داد که ‮‭547‬ ‭B. maritima ‬و توده های ‭SB‬‮‭23‬ و M‮‭211‬ از گونه ‭B. vulgaris ‬با فراوانی بوته های مقاوم بالای ‮‭60‬ درصد جز ژرم پلاسم های مقاوم به ‭P. betae ‬می باشند. واژه های کلیدی: چغندر قند، مقاومت، ریزومانیا، ‭Polymyxa betae‬، ‭BNYVV