تشخیص اوی باکتریوم (هموفیلوس) پاراگالینارم (عامل کوریزای عفونی) به روش ‭PCR ‬کشت

تشخیص اوی باکتریوم( هموفیلوس) پاراگالینارم (عامل کوریزای عفونی) به روش ‭PCR ‬و کشت اوی باکتریوم ( هموفیلوس ) پاراگالینارم ‭(Avibacterium Paragallinarum ) ‬باکتری گرم منفی است که عامل ایجاد بیماری حاد تنفسی کوریزای عفونی در طیور می شود. کوریزای عفونی در بیشتر کشور ها دیده می شود و خسارات اقتصادی در کشور های توسعه نیافته به همراه دارد. گله های طیور تخمگذار و مادر در ایران نیز علی رغم مصرف واکسن همچنان بیماری را تجربه ممکن است کنند. آزمایش استاندارد تعیین سرووار های عامل این بیماری انجام ‭HI ‬با استفاده از سرم های استاندارد بروش ‭Kume ‬می باشد. در این روش تاکنون 9 سرووار (4‭-A-‬،1 ‭A-‬،2 ‭A-‬،3 ‭A-‬،4 ‭B-‬،1 ‭C-‬،1 ‭C-‬،2 ‭C-‬،3 ‭C ) ‬شناسایی شده است. این سرووار ها در برخی موارد مشخص گردیده که پوشش ایمنی متقاطع کاملی ما بین خود ندارند. روش اولیه تعیین سروتیپ این باکتری توسط ‭Page ‬معرفی شده بود که بر مبنای روش انجام ‭HI ‬او باکتری هموفیلوس پاراگالینارم به سه ( گروه ) سروتیپ ‭(A‬، B، ‭C ) ‬طبقه بندی می گردید. باکتری های این گروه بندی پوشش ایمنی در مقابل یکدیگر ایجاد نمی کنند. بر این اساس در کشور ما اطلاعاتی در خصوص سروتیپ های شایع این باکتری وجود ندارد. اخیرا با ابداع روش ‭PCR ‬در تشخیص باکتری و بوجود آمدن امکان تفریق باکتری ها بر اساس گروه بندی ‭Page‬، این مطالعه به منظور راه اندازی آزمایش واکنش زنجیره ای پلی مراز ‭(PCR) ‬در تشخیص و تعیین سرووار انجام گردید. این مطالعه بر روی دو جدایه مطالعه شده قبلی ایران و دو سرووار استاندارد A، ‭C (‬وارداتی ) موجود در موسسه رازی که در زرده تخم مرغ ذخیره سازی شده اند انجام گرفت. این جدایه ها بطور غیر عمدی غیر فعال شده و تجدید کشت آنها منفی بوده است. استخراج ‭DNA ‬ژنوم به روش فنل- کلروفرم از زرده تخم مرغ مشخص ساخت در مقایسه با روش های معمول توصیه شده، نیاز مند اعمال تغییراتی در روش کار است. روش استخراج ‭DNA ‬باکتری از زرده تخم مرغ از نظر کیفی تا رسیده به مرحله امکان ردیابی ژنی باکتری در آزمایش ‭PCR ‬بهینه سازی آنها صورت گرفت. این بهینه سازی شامل مقدار آنزیم پروتییناز و مدت زمان آنکوباسیون و نیز انجام دو مرحله شستشو با اتانول بود. سپس محصول های استخراج تحت دو آزمایش مولکولی ‭PCR ‬با استفاده از پرایمر های ویژه گروه باکتری به منظور تعیین حضور ژنوم باکتری و آزمایش ‭PCR ‬دیگر بر اساس پرایمر های منتشر شده مربوط به مکانهای خیلی متغیر توالی ژنی پروتیین هماگلوتینین، جهت تعیین وابستگی آنها به سرووار های A، B، ‭C ‬قرار گرفتند. در نتایج ‭PCR ‬تعیین گروه مشخص شد، همه نمونه ها بجز استاندارد ‭C ‬حاوی ژنوم باکتری می باشند. در آزمایش ‭PCR ‬تعیین سرووار نمونه های ‭DNA ‬استخراج شده، در ژل الکتروفورز محصول مربوط به دو نمونه جدایه استان خراسان (رضوی) باند ویژه سرووار ‭B (bp‬‮‭1100‬) دیده شد و هیچ یک از نمونه های استاندارد محصولی را نداشتند. درطی این مطالعه همچنین با بدست آوردن جدایه ای تازه از این استان مراحل شناسایی فوق بر روی آن انجام گرفت و پس از شناسایی آن بعنوان سرووار A، محصول ‭PCR ‬مربوطه جهت اطمینان تعیین توالی گردید و مقایسه آن با اطلاعات بانک، جهانی ژنی نشان داد ‮‭99‬درصد همسانی با بخشی از توالی ژنی پروتیین هماگلوتینین سرووار ‭A ‬دارد. همچنین در پروژه، بر روی ‮‭17‬ مورد نمونه سر پرنده های مشکوک ارجاع شده به موسسه، کشت باکتری سواپ سینوسی زیر چشمی بمنظور جدا سازی و آزمایش ‭PCR (‬ویژه گروه) برای ردیابی حضور باکتری انجام گرفت. این موارد نتایجی بهمراه نداشتند. با توجه به نتایج این مطالعه پیشنهاد بکار گیری این آزمایش در شناسایی و تعیین سرووار باکتری اوی باکتریوم پاراگالینارم، بعنوانی آزمایشی سریع در موارد مشکوک نمونه های بالینی می شود. این گزارش اولین مورد تایید تشخیص سرووار ‭B ‬باکتری اوی باکتریوم پاراگالینارم در ایران می باشد. کلمات کلیدی: اوی باکتریوم پاراگلینارم، زرده تخم مرغ، کوریزای عفونی، تعیین سروتیپ