مطالعه مسیر بیوشیمیایی و ژن های دخیل در بیوسنتز سیلیمارین درکشت سوسپانسیون سلولی و ریشه های مویین گیاه خارمریم به منظور افزایش سطح تولید سیلیمارین

سیلیمارین، ترکیب شیمیایی زیست-فعال موجود در عصاره حاصل از بذرهای گیاه خارمریم ‭(Silybum marianum (L.) Gaertn)‬، اغلب در درمان بیماری های کبدی مورد استفاده قرار می گیرد. به منظور بررسی مطالعه مسیر بیوشیمیایی و ژن های دخیل در بیوسنتز سیلیمارین در گیاه خار مریم و ارایه راهکارهای افزایش تولید سیلیمارین بر پایه تجربیات حاصل از پروژه های خاتمه یافته، تعدادی از پروژه ها در پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران در قالب یک طرح تحقیقاتی تحت عنوان " مطالعه مسیر بیوشیمیایی و ژن های دخیل در بیوسنتز سیلیمارین درکشت سوسپانسیون سلولی و ریشه های مویین گیاه خار مریم به منظور افزایش سطح تولید سیلیمارین " ارایه شد. به منظور بررسی اثرات به کار گیری الیسیتورها در تولید سیلیمارین در کشت سوسپانسیون سلولی اثرات ‭AgNO‬3 و ‭PbNO‬3 ، عصاره مخمر و سالیسیلیک اسید در کشت سوسپانسیون سلولی گیاه خار مریم در 6 زمان نمونه برداری ارزیابی شد و اثرات آن ها بر روند رشد سلول ها و میزان تولید سیلی مارین بررسی شد. به منظور مطالعه دقیق کمی و کیفی فلاونولیگنان ها، از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا ‭(HPLC) ‬استفاده گردید. نتایج ما نشان دادند که کشت سوسپانسیون سلولی گیاه خارمریم حاوی مقادیر بالایی از فلاونولیگنان ها شامل سیلی کریستین، سیلی دیانین، سیلی بین، ایزوسیلیبین و تاکسی فولین می باشد‭. AgNO‬3 به طور معنی داری باعث افزایش تولید سیلی مارین در کشت سوسپانسون سلولی گیاه خارمریم گردید که میزان آن حدود ‮‭30‬ برابر بیشتر از گروه شاهد بود. در محیط های تیمار شده با سالیسیلیک اسید، عصاره مخمر و ‭PbNO‬3 میزان تولید سیلی مارین به ترتیب ،‮‭15 18‬ و 2 برابر بیشتر از میزان آن نسبت به گروه شاهد بود. این مطالعه نشان داد که کشت سوسپانسیون سلولی گیاه خارمریم بسیار مستعد تحریک با محرک ها می باشد. همچنین پروژه دیگری به منظور شناسایی و بررسی عوامل محرک در بیوسنتز سیلیمارین در کشت های ریشه های مویین گیاه خار مریم که با تراریخت سازی ژنتیکی از طریق آگروباکتریوم ریزوژنز، به منظور افزایش تولید متابولیت های ثانویه، ایجاد شده بودند، انجام شد. از غلظت های مختلف محرک ها (سالیسیلیک اسید ،متیل جاسمونات و ‭Ag+) ‬در زمان های مختلف استفاده شد و تایید تراریختی به روش ‭PCR ‬برای ریشه های حاوی ژن ‭rolb ‬انجام شد. نتایج نشان داد که بالاترین میزان سیلیمارین در غلظت 6 ‭mg/‬‮‭50‬ ‭ml culture ‬سالیسیلیک اسید و در غلظت 2 ‭Ag+ mM ‬و در غلظت متیل جاسمونات ‮‭100‬ ‭M ‬تولید شد. بهترین غلظت انتخاب شده در زمان های مختلف به ریشه ها اعمال شد. نتایج نشان داد که بالاترین میزان تولید سیلیمارین در ریشه های تیمار شده با محرک سالیسیلیک اسید ‮‭24‬ ساعت پس از اعمال تیمار و ‮‭2/42‬ برابر شاهد، در ریشه های تیمار شده با محرک ‮‭96 , +Ag ‬ساعت پس از اعمال تیمار و ‮‭3/68‬ برابر شاهد و در ریشه های تیمار شده با محرک متیل جاسمونات، ‮‭96‬ ساعت پس از اعمال تیمار و ‮‭3/49‬ برابر شاهد بود. بیشترین وزن خشک نیز در تیمار با محرک های سالیسیلیک اسید، ‭Ag+ ‬و متیل جاسمونات به ترتیب ،‮‭120 24‬ و ‮‭24‬ ساعت پس از اعمال تیمار مشاهده شد. به منظور بررسی مسیر سیگنالینگ منجر به تولید سیلیمارین روند تغییرات فعالیت آنزیم های لیپوکسیژناز، پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز و تجمع پراکسید هیدروژن بوسیله دستگاه اسپکتروفتومتری و تجمع لینولییک اسید به روش کروماتوگرافی گازی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان دادکه تیمار با محرک سبب فعال شدن سیستم دفاعی ضد اکسنده در گیاه و افزایش تجمع پراکسید هیدروژن و افزایش فعالیت آنزیمصهای پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز در ریشه های تیمار شده می شود و همچنین تیمار با محرک سبب افزایش تجمع لینولییک اسید و افزایش فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز می شود. به منظور بررسی اثر واسطه ایی، لازم است مقدار هورمون های گیاهی و تنظیم کننده های مورد نظر در پاسخ به انواع محرک ها اندازه گیری شود. در این مطالعه، از عصاره مخمر، متیل جاسمونات و کیتین به عنوان محرک ریشه های مویین خارمریم در زمان های مختلف تیمار استفاده شد. استخراج و اندازه گیری سالیسیلیک اسید و جاسمونیک اسید درونی نمونهصها به روش کروماتوگرافی گازی و اسپکترومتری جرمی ‭(GC/MS) ‬انجام شد. نتایج نشان داد حداکثر مقدار سالیسیلیک اسید در ریشه های مویین تحریک شده با عصاره مخمر ‮‭72‬ ساعت پس از اعمال تیمار و به مقدار ‮‭59/93‬ میکرو گرم بر گرم وزن خشک بوده است و در ریشه های مویین تحریک شده با متیل جاسمونات ‮‭24‬ ساعت پس از اعمال تیمار و به مقدار ‮‭68/45‬ میکرو گرم بر گرم وزن خشک بوده است. در زمان های مشابه با افزایش سالیسیلیک اسید بیشترین مقدار سیلیمارین مشاهده. در تیمار با عصاره مخمر مقدار جاسمونیک اسید تقریبا ثابت بوده، در حالیکه در اثر تیمار با متیل جاسمونات افزایش ‮‭1/67‬ برابر نسبت به کنترل مشاهده شد. در ریشه های مویین تحریک شده با کیتین بیشترین مقدار سالیسیلیک اسید و جاسمونیک اسید پس از ‮‭72‬ ساعت از اعمال تیمار و به ترتیب ‮‭62/67‬ و ‮‭59/14‬ میکرو گرم بر گرم وزن خشک بوده و یک مرحله بعد از بیشترین مقدار تجمع سیلیمارین (‮‭2/8‬ میکرو گرم بر گرم وزن خشک) مشاهده شد. روش اندازه گیری فعالیت آنزیم چالکون سنتاز در بخش های مختلف گیاه خارمریم با استفاده از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا بهینه و فعالیت آن در مراحل مختلف رویشی تعیین شد. با روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا مقدار نارینجنین اندازه گیری شد. این روش ساده، سریع و کم هزینه می باشد و جایگزین روش رادیومتری است که به طور متداول در سنجش آنزیم چالکون سنتاز به کار می رود. به منظور شناسایی عوامل دخیل در بیوسنتز سیلیمارین پروتیوم ریشه های مویین گیاه خارمریم تیمار شده با ‭MeJA ‬مطالعه شد. از بین ‮‭670‬ لکه پروتییمی بررسی شده ‮‭32‬ لکه کاهش یا افزایش بیان نشان می دادند.پروتیین های پاسخ دهنده به ‭MeJA ‬با استفاده از ‭MALDI TOF-T