راه اندازی یک روش سریع و دقیق برای تشخیص ویروییدهای مرکبات به منظور استفاده از آن در تولید نهال سالم مرکبات

استان مازندران با سطح زیر کشت بیش از یکصد هزار هکتار، مهمترین منطقه کاشت مرکبات در ایران است. درختان مرکبات در این استان عموما از تکثیر پیوندکهایی به دست آمده اند که از نظر آلودگی به بیماری های مسری کنترل نشده و به همین لحاظ احتمال آلودگی به ویروییدها در بین این درختان وجود دارد. ویروییدهای کاچکسیا ‭(Citrus cachexia viroid) ‬و اگزوکورتیس ‭(Citrus exocortis viroid) ‬مهمترین بیماریهای ویروییدی مرکبات در جهان را موجب می گردند. در ماه های مختلف سال ‮‭1389‬ بازدید از باغات مرکبات شرق استان مازندران(شهرستان های بابل تا ساری) انجام گرفت و در مجموع بیست و دو نمونه مشکوک به آلودگی ‭CCaVd ‬و پانزده نمونه مشکوک به آلودگی ‭CEVd ‬جمع آوری شد. با رعایت تنوع جغرافیایی و نوع پایه- پیوندک، ده نمونه جمع آوری شده مشکوک به آلودگی کاچکسیا و هشت نمونه جمع آوری شده مشکوک به آلودگی اگزوکورتیس برای بررسی بیولوژیکی روی گیاهان محک انتخاب شدند. آلوده سازی گیاهان محک از طریق پیوند پوست نمونه های جمع آوری شده انجام شد. علایم روی گیاهان محک دوازده تا پانزده ماه پس از مایه کوبی مورد ارزیابی قرار گرفتند. از هر نهال محک سه تکرار برای هر نمونه جمع آوری شده به همراه دو نهال مایه کوبی نشده از هر رقم مورد مطالعه به عنوان شاهد در نظر گرفته شد. جدایه های مورد بررسی کاچکسیا ا از نظر بیولوژکی به دو گروه شدیدو ملایم تقسیم بندی گردید. گیاه لیمو مکزیکی با علایم ریزبرگی و لکه های حلقوی زرد رنگ برای شناسایی جدایه های کاچکسیای تحت مطالعه مناسب بودند. جدایه های اگزوکورتیس مورد بررسی نیز به دو گروه شدید و ملایم تقسیم بندی شد. نهال بالنگ اتراگ با بروز علایم کوتولگی، زردی برگها و پیچیدگی برگ به سمت پایین‭(Epinasty)‬، قادر به شناسایی انواع جدایه های اگزوکورتیس بود. خالص سازی نمونه ها با روش ستون کروماتوگرافی و با استفاده از سلولز ‮‭11‬‭-CF ‬انجام شد. غلظت اتانول مورد استفاده در این روش معادل ‮‭17‬ درصد در نظر گرفته شد. رهاسازی نوکلییک اسید با افزودن بافر ‭STE ‬بدون الکل اتانول انجام شد. نمونه ها با اتانول مطلق رسوب داده شده و در ژل آگارز یک درصد الکتروفورز صورت گرفت. برای هر یک از نمونه های تحت بررسی دو باند، یک باند در محدوده ‮‭300‬ تا ‮‭400‬ جفت باز و یک باند در محدوده ‮‭7000‬ جفت باز به دست آمد. باند سنگین تر(‮‭7000-7500‬ جفت باز) برای جدایه های مربوط به هر دو ویرویید در تمامی فصول سال قابل مشاهده بود، اما باند سبک تر( ‮‭300‬ تا ‮‭400‬ جفت باز) در ماههای گرم سال( فروردین تا اواخر مهر ماه) قابل رویت بود اما در فصول سرد سال( آبان تا اواخر اسفند ماه) در اغلب مواقع غلظت بسیار پایین و به سختی قابل مشاهده بود. برای تایید ماهیت و نوع نوکلییک اسید خالص شده با این روش، از تیمار با آنزیم ‭DNaseI ‬و‭RNaseA ‬در حضور نمک ‭NaCl ‬استفاده شد. رسوب حاصل از استخراج اسید نوکلییک با روش خالص سازی ستون ‮‭11‬‭-CF ‬پس از تیمار باآنزیم ‭RNaseA ‬درحضور ‮‭0/3‬ مولار نمک طعام، باندی در حدود‮‭7000‬ ‭bp ‬در ژل آگارز یک درصدظاهر نمود، درحالیکه در نمونه تیمار شده با آنزیم ‭RNaseA ‬در غیاب ‭NaCl ‬باندی تشکیل نگردید. تیمار این نمونه با آنزیم ‭DNaseI ‬نیز باندی در حدود ‮‭7000‬ ‭bp ‬در ژل آگارز تشکیل داد. در مسیر نمونه خالص سازی شده از بافت گیاه سالم نیز باندی مشاهده نشد. با توجه به جدید بودن این روش لازم بود برای تایید ماهیت ویروییدی باندهای نوکلییک اسیدی که در ژل الکتروفورز با روش ستون‮‭11‬‭-CF ‬به دست آمده بودند، از واکنش زنجیره ای پلی مراز به همراه نسخه برداری معکوس‭(RT PCR ) ‬با آغازگرهای اختصاصی متعلق به ویروییدهای کاچکسیا و اگزوکورتیس استفاده شود. نمونه های آلوده به اگزوکورتیس و کاچکسیا هر کدام با آغازگر اختصاصی خود باندی در حدود ‮‭300-400‬ نوکلیوتید ایجاد کردند. در مسیر نمونه سالم تیمار شده با آغازگرهای اگزوکورتیس و کاچکسیا نیز باندی مشاهده نشد. لذا مشخص گردید که آنچه توسط ستون سلولزی ‮‭11‬‭-CF ‬خالص و به دست آمده با داشتن ساختمان دو رشته ای و ماهیت ‭RNA ‬، مربوط به هر یک از دو ویرویید کاچکسیا و اگزوکورتیس بوده است. با توجه به نتایج به دست آمده، روش خالص سازی با ستون ‮‭11‬‭-CF ‬به طور اختصاصی قادر به جداسازی و شناسایی رشته های ویروییدی در درختان مبتلا به دو بیماری مهم ویروییدی مرکبات، یعنی اگزوکورتیس و کاچکسیا بود و با اطمینان و دقت کافی بدون نیاز به استفاده از روشهای دیگر به صورت کاربردی در بخش های تولید نهال سالم برای ردیابی آلودگی های ویروییدی از این روش می توان استفاده نمود. در محدوده باندهای ویروییدی به دست آمده در این روش باندهای ‭RF ‬اصلی ویروس های مرکبات قرار نمی گیرند، بدین لحاظ امکان تفکیک باندهای مربوط به ویروییدهای مرکبات از باندهای ویروس های بیمارگر مرکبات به خوبی وجود دارد. واژه های کلیدی: ویرویید مرکبات، ستون ‮‭11‬‭-CF ‬، کاچکسیا، اگزوکورتیس