بررسی تشکیل ذرات عفونی روتاویروس های با منشا گاوی با استفاده از روش انتقال ژن در ‭3 ‬لاین سلولی

روتاویروس ها یکی از اعضای خانواده ی ریوویریده و عامل اصلی بیماری های اسهالی شدید در بین کودکان و حیوانات اهلی از جمله دام ها می باشد. این بیماری یکی از عوامل مهم مرگ و میر در سال های اول تولد به خصوص در کشورهای در حال توسعه می باشد. ساختار روتاویروس ها شامل سه لایه پروتیین و ‮‭11‬ قطعه ‭RNA ‬دورشته ای است. مجموع سه پروتیین ‭VP‬1، ‭VP‬2و ‭VP‬3 پوشش هسته ی داخلی ویریون را ایجاد می کند‭. VP‬1 پروتیین ‭RNA ‬پلی مراز وابسته به ‭RNA ‬در ویروس می باشد و حضور ‭VP‬2 برای تحریک همانندسازی و نسخه برداری ‭VP‬1 ضروری است. مطالعات قبلی در محیط خارج سلولی نشان می دهد که حضور سه پروتیین ‭VP‬1، ‭VP‬2 و ‭VP‬3 برای همانندسازی ویروس ضروری است. هدف این است که نشان دهد سه پروتیین ‭VP‬1، ‭VP‬2 و‭VP‬3 به تنهایی قادر هستند علاوه بر همانندسازی، بسته بندی ساختار ویروس را نیز انجام دهند. در این مطالعه سه ژن ‭VP‬1،‭VP‬2 و ‭VP‬3 در پلاسمید بیانی پستانداران ‭(pcDNA‬‮‭1.3‬) کلون شدند. سپس هر سه پلاسمید به همراه ژنوم ‭dsRNA ‬به سلول های ‭MA‬‮‭104‬ ترانسفکت شدند. پس از گذشت ‮‭60‬ ساعت از ترانسفکشن و مشاهده ی 2 ،‭CPE ‬پاساژ به سلول ها داده شد. سپس سلول ها فیکس شده و توسط میکروسکوپ الکترونی ‭(TEM) ‬و با رنگ آمیزی مثبت مشاهده شدند. همچنین تولید پارتیکل های ویروسی توسط ‭RT-PCR ‬و با پرایمرهای ‭VP‬6 مورد تایید قرار گرفت. پس از انجام آزمایشات پارتیکل های کامل ویروسی با توانایی اثر بر روی سلول در زیر میکروسکوپ الکترونی با رنگ آمیزی مثبت مشاهده شدند. این نتایج نشان دادند که حضور سه پروتیین ‭VP‬1 ، ‭VP‬2 و ‭VP‬3 برای همانندسازی و بسته بندی ساختار ویروس لازم و کافی است. همچنین ‭RT-PCR ‬ژن ‭VP‬6 حضور پارتیکل های کامل ویروسی را تایید کرد. از آنجایی که ‭VP‬1، ‭RNA ‬پلی مراز وابسته به ‭RNA ‬است، مطالعه بر روی این پروتیین در فرایندهای همانندسازی مربوط به روتاویروس بسیار مورد توجه است. علاوه بر این، این مطالعه نشان می دهد که سه ژن ‭VP‬1،‭VP‬2 و‭VP‬3 همانندسازی و پروتیین سازی را در محیط داخل سلولی به تنهایی هدایت می کند. جداسازی روتاویروس در حال حاضر از طریق فیلتراسیون نمونه های مدفوعی آلوده صورت می گیرد. با این روش جدید می توان ویروس را در مقدار بالا، آسان تر و با هزینه ی کمتر به دست آورد. این روش آسان و بی دردسر باعث سهولت و تمرکز بیشتر در مطالعات مربوط به واکسن می شود. ضرورت انجام این تحقیق از این جهت مطرح می باشد که باعث ارایه و پایه ریزی روش جدیدی بر اساس به کارگیری روش انتقال ژن در به دست آوردن ذرات عفونی روتاویروس می شود و در صورت موفقیت می توان آن را برای جداسازی ویروس های دیگر با ساختار و عملکرد مشابه و حتی ویروس های نوترکیب جدید تعمیم داد.