تهیه کیت الیزای اپسیلون کلستریدیوم پرفرنجنس تیپ ‭D ‬جهت تشخیص و کنترل

باکتری کلستریدیوم پرفرنژنس عامل آنتروتوکسمی، یک باکتری گرم مثبت تولید کننده اسپور است و در پنج تیپ ‭A ‬، ‭B ‬، ‭C ‬، ‭D ‬و ‭E ‬بر اساس تولید چهار نوع توکسین کشنده آلفا، بتا، اپسیلون و یوتا طبقه بندی می شود. توکسین اپسیلون با وزن مولکولی حدود ‮‭34‬ کیلودالتن جزو توکسین های ‭pore-forming ( ‬ایجاد کننده منفذ) است و از قویترین توکسین های خانواده کلستریدیوم هاست. به علت نقش این توکسین در ایجاد بیماری در انسان و دام ، استفاده از روش های تشخیصی با حساسیت بالا و توان تعیین حضور آنتی سرم علیه توکسین اپسیلون جهت تشخیص توکسین و در نتیجه باکتری کلستریدیوم پرفرنژنس تیپ ‭D ‬از اهمیت بالایی برخوردار است. پس از تهیه و کنترل باکتری کلستریدیوم پرفرنژنس تیپ ‭D ‬و تایید نهایی رشد و آزمون های کنترلی جهت بررسی توکسین اپسیلون ، مراحل خالص سازی توکسین با استفاده از تغلیظ ( رسوب دهی آمونیوم سولفات ) ، دیالیز رسوب پروتیینی و در نهایت کروماتوگرافی تعویض یونی با استفاده از بید سفادکس ‭DEAE ‬صورت گرفت. مراحل کنترل خلوص پروتیین با استفاده از روش ‭SDS-PAGE ‬بررسی و میزان خلوص تعیین گردید. پروتیین تخلیص شده به خرگوش و بز و گوسفند (جهت تهیه کنترل مثبت مورد استفاده در آزمون الیزا ) تزریق گردید. جهت بررسی کراس و نیز تایید خلوص آنتی بادی از روش وسترن بلاتینگ استفاده شد . پس از انجام مراحل آماده سازی مواد تشکیل دهنده کیت، ابتدا توکسین خالص شده با غلظت مشخص ( مشخص شده توسط آزمون های الیزا و بررسی چکربورد ها ) در کف پلیت‮‭96‬ تایی الیزا کوت شد و با غلظت مناسب محلول بلاکینگ بافر ، بلاک گردید و پس از گذراندن مراحل آماده سازی بصورت کیت به همراه غلظت های مناسب آنتی سرم بسته بندی گردید. در راستای کنترل کیت آماده شده، اختصاصیت و حساسیت با استفاده از چکربوردهای مختلف و انجام آزمون های الیزا مورد بررسی قرار گرفت و غلظت های مناسب آنتی بادی استفاده شده بعنوان تست و کنترل و میزان ‭cut-off ‬تعیین گردید. میزان خلوص توکسین استفاده شده جهت استفاده در بافر پوشاننده ‮‭80‬ درصد و مقدار توکسین کوت شده در هر چاهک (6‭ng/well) ‬بود. آزمون الیزا و وسترن بلات های اولیه نشان دهنده اختصاصیت بالای آنتی بادی تولید شده بر علیه آنتی ژن بود. میزان ‭cut-off ‬محاسبه شده در آزمون ‮‭0/15‬ برآورد شد و در آزمون کراس مشخص شد که کیت برای شناسایی توکسین اپسیلون کاملا اختصاصی عمل می نماید و میزان تکرار پذیری کیت نیز با استفاده از انحراف معیار بسیار بالا ارزیابی گردید. آزمون های صورت گرفته نشان داد که کیت الیزای غیرمستقیم جهت تشخیص توکسین اپسیلون باکتری کلستریدیوم پرفرنژنس ساخت موسسه رازی جهت استفاده در آزمون های تشخیصی و کلینیکی قابلیت های لازم را دارا می باشد کلمات کلیدی: اپسیلون توکسین، کیت تشخیصی، کلستریدیوم پرفرنژنس، آنتی بادی پلی کلونال.