مدلسازی مولکولی در شناسایی ژن دارویی آسپارژیناز

آسپاراژیناز‭II ‬از خانواده آمیدوهیدرولازها، با هیدرولیز آسپاراژین خون و کاهش سطح خونی آن موجب از بین رفتن سلولهای توموری وابسته به آسپاراژین خون بویژه در لوکمی لنفوبلاستیک حاد می شود. با توجه به مشکلات تهیه و استفاده از این دارو، عمده تلاشهای دانشمندان د ر جهت تهیه ژنهای آسپاراژیناز‭II ‬بوده است که کمترین عوارض جانبی و بیشترین پایداری را داشته باشد. بدین منظور استراتژی های متعددی بکار رفته است. از جمله می توان به جستجو جهت یافتن ژنها و منابعجدید آنزیم با توان ضد سرطانی و بهبود کارایی آنزیم های موجود با پوشش نانوییو یا استفاده حامل های مناسب اشاره کرد.این طرح در سه سطح مطالعاتی انجام گردید. در سطح اول آنزیم آسپاراژیناز از گونه های متعددی از باکتری های گرم منفی جداسازی شناسایی شده و در بانک ژن ثبت شد. این باکتریها شامل شیگلا فلکسنری ‮‭2264‬ ‭RTCC‬، سالمونلا تیفی موریم ‮‭112‬ ، سیترو باکتر فروندی ‭RTCC‬‮‭1101‬، کلبسیلا نومونی آ ‮‭1003‬ ‭ATCC ‬و ( ،‮‭116‬ اشیر شیا کلی‭BL‬‮‭21‬‭(DE‬3‭)pLysS ‬و K‮‭12‬ اروینیا کریزانتمی ‮‭4610‬ ‭DSM ‬بود. در سطح دوم ساختار فضایی آنزیم در میان ایزوله های مختلف با همدیگر مقایسه گردید و نقش توالی های مختلف اسپاراژینازی از نظر ویژگی سوبسترایی و آنزیمیبررسی گردید بدین منظور از نرم افزار ‭InsightII ‬و با همکاری آزمایشگاه کریستالوگرافی و مدلسازی مولکولی ‭Macromolecular Crystallography Laboratory ‬،‭NCI‬، ‭NIH Maryland‬، ‭washingtown‬،‭USA ‬استفاده شد. روش بکار رفته در تعیین ساختار های فضایی، استفاده از شباهت های موجود بین ساختارهای شناسایی و ثبت شده در پایگاه اطلاعات پروتیین ‭(PDB) ‬و ژنهای مورد نظر بوده است‭(Similarity Modeling). ‬ساختمانهای بدست آمده آنالیز شده و بهترین کاندیدا های تعیین شده بدین منظور ژنهای آسپاراژیناز اشیر شیا کلی و سیتروباکتر فروندی بود. در سطح سوم یکی از آنزیم های شناسایی شده(ژن آسپاراژیناز ‭E.coli K‬‮‭12‬) کلون و بیان گردید و سپس در مقادیر بالا تولید و خالص شده و بصورت نانوذرات با حامل کیتوزان تهیه شده و ویژگی های آن بعنوان آنزیم دارویی ارزیابی گردید. بدین منظور انزیم آسپاراژیناز از سویه K‮‭12‬ اشرشیا کلی کلون شدهمراحل بیان ژن جهت بدست آوردن حداکثر محصول آزمایشگاهی اپتیمایز شد. سطح بیان حاصل از روش اپتیمایز شده ‮‭5.12‬ برابر روش معمول بود. بمنظور پایدارسازی آسپاراژیناز‭II ‬از پلیمر کیتوزان کراس لینک شده با تری پلی فسفات استفاده و مراحل تهیه نانوپارتیکل اپتیمایز شد. سپس نسبت اپتیمم پلیمر به کراس لینکر، جهت اپتیمایز لودینگ پروتیین استفاده شد. نانوپارتیکل بدست آمده از حداکثر لودینگ پروتیین جهت تعیین ویژگی از جمله بررسی های ‭FTIR‬، ‭TEM‬، توانایی رهش، نیمه عمر و پایداری در برابر ‭pH ‬و دما استفاده شد. نتیجه این بررسی ها نشان داد که آسپاراژیناز‭II ‬در نانوپارتیکل های کروی شکل کیتوزان لود شده است. عوامل محیطی مثل ‭pH‬، قدرت یونی و جاذبه های الکتروستاتیکی روی رهش دارو از نانوپارتیکل تاثیر دارند. نیمه عمر آنزیم ایموبیلایز شده در نانوپارتیکل های کیتوزانی ‮‭23‬ برابر آنزیم آزاد برآورد شد. پایداری آنزیم ایموبیلایز در برابر ‭pH ‬تقریبا مشابه آنزیم آزاد بود اما پایداری آن در دماهای بالا بیشتر از آنزیم آزاد بود. کلید واژه ها: آسپاراژیناز‭II‬، کلون کردن،مدلسازی مولکولی، بیان ژن، نانوپارتیکل