بیان موفق و بالای پروتئین های نوترکیب انسانی در کلروپلاست، مطالعه موردی: پروتئین فعالکننده پلاسمینوژن بافتی (tPA)

با شناخت کلروپلاست به عنوان یک اندامک ارزشمند در انتقال ژن، بر بسیاری از مشکلات مربوط به تراریختی هسته گیاه از جمله مسائل مرتبط باایمنی زیستی محصولات تراریخت غلبه شد. در این مقاله ضمن بر شمردن خصوصیات منحصر بفرد کلروپلاست در تولید پروتئین های نوترکیب انسانی مختلف، به قابلیت این اندامک در بیان پروتئینtPAفعال کننده پلاسمینوژن بافتی اشاره خواهد شد. پروتئین انسانیTPAفعال کننده پلاسمینوژن بافتی نوترکیب یکی از مهمترین پروتئینهای نوترکیب داروئی است که به منظور از بین بردن لخته خون در بخشهای مختلف بدن از جمله رگهای خونرسان به قلب و مغز استفاده میشود. به منظور انتقال ژنK2Sفرم اصلاح شده پلاسمینوژن بافتی) به کلروپلاست گیاه توتونcDNAمربوطه ابتدا در ناقلpTZ57R/Tدرج و پس از برش آنزیمی در ناقل کلروپلاستیpKCZخاص گیاه توتون درج و در باکتریE.coliسویهDH5αهمسانهسازی شد. جهت تسهیل تخلیص محصول پروتئین تولیدی از طریق کروماتوگرافی، توالی شش هیستیدین و توالی پروتئازی فاکتورXaبه انتهای آمینی ژنK2Sالحاق یافت. ناقل حامل ژن هدف با استفاده از روش زیستپرتابی، به ریزنمونههای برگی شلیک شدپس از انتقال ریزنمونههای به محیط گزینشگر حاوی آنتی بیوتیک اسپکتینومایسین، جوانههای تراریخته باززایی، به منظور رسیدن به هموپلاسمی زیرکشتهای متعدد و حداقل سه دوره باززایی نوساقه در حضور آنتیبیوتیک گزینشگر انجام شد. حضور و تلفیق تراژنK2Sدر گیاهان ترانس پلاستومیک با آنالیزPCRو هموپلاسمی به کمک کاوشگرهای طراحی شده و آزمون دورگهسازی به روش سادرن به تایید رسید. ارزیابی بیان ژن هدفK2Sو میزان پروتئین تولیدی با آنالیزSDS-PAGE ،RT-PCRلکهگذاری نقطهای، وسترنبلات و الایزا انجام شد. فعال بودن پروتئین تولید شده در گیاهان تراریخته با آزمون زیموگرام تایید شد. بذور گیاهان تراریخت به منظور اطمینان از انتقال ژن به نسل بعد، کشت و گیاهان نسلT1از نظر حضور، بیان ژنtPAمورد ارزیابی قرار گرفتند. نتایج این تحقیق مبین انتقال و بیان موفق ژنtPAو حضور پروتئین در شکل فعال در گیاهانتراریخت و انتقال موفق ژنTPA درنسل T1است. نتایج نشان داد اندامک کلروپلاست به عنوان یک بیوراکتور طبیعی از پتانسیل خوبی جهت بیان TPA برخوردار است

کلیدواژه ها:

کشاورزی مولکولی ، تراریختی کلروپلاست ، پروتئین نوترکیب ، Tpa