نشانگرهای زیستی مرتبط با پاسخ ایمنی به ویروس آنفولانزا مبتنی ‎بر رویکرد زیست شناسی سامانه ای در مرغ

چکیده مبسوط مقدمه و هدف: در سال های اخیر، ویروس آنفولانزا منجربه خسارات اقتصادی سنگینی در صنعت طیور به‎ ویژه گله های گوشتی شده ‎است که علی‎رغم انجام برنامه واکسیناسیون، همچنان از مهم‎ترین عوامل بیماری ‎زا در صنعت طیور در سراسر جهان است. آنفولانزای پرندگان، به ویژه سویه H۵N۱، به‎دلیل پتانسیل آن به‎عنوان بیماری مشترک بین انسان و دام و تاثیر مخرب آن بر جمعیت طیور، به‎عنوان نگرانی‎ عمده بهداشت جهانی مطرح شده ‎است. با این انگیزه تحقیقاتی، شناسایی مکانیسم های مولکولی پاسخ به عفونت برای کنترل، درمان و پیشگیری از بیماری همه گیر، امری حیاتی است. از جمله اهداف کلیدی در تحقیقات زیستی، شناسایی منسجم تمام مولکول های درون‎ سلولی زنده و نحوه تعامل بین آن‎ها است. بیان هم‎زمان ژن، اطلاعات کلیدی را برای درک سیستم های زنده فراهم می کند، زیرا ژن های هم بیان اغلب در مسیرهای زیستی یکسان یا مرتبط با برهمکنش پروتئین_پروتئین (PPI) هستند. نیاز به استراتژی های موفق درمانی نگارندگان را به مطالعه شبکه های تعامل پروتئین-پروتئین از طریق رویکردهای مبتنی‎ بر زیست شناسی سیستمی به‎عنوان روشی مناسب برای کشف پروتئین های کاندید و مسیرهای بیولوژیکی کلیدی در این بیماری واداشته است. از آن‎جایی‎ که اندازه گیری شاخص های مرکزیت معیاری برای تعیین تاثیر عضوها در شبکه تعاملی است، از شاخص های مرکزیت بینابینی، نزدیکی و تعداد اتصال عضو برای تجزیه و تحلیل شبکه های پروتئینی استفاده می شود. این مطالعه، با هدف شناسایی نشانگرهای زیستی کلیدی در تشخیص، درمان یا کنترل تلفات و خسارات ناشی از بیماری آنفولانزای مرغی با استفاده از روش های آنالیز شبکه های زیستی و تحلیل مسیرهای سیگنال دهی-عملکردی انجام شد. مواد و روش‎ ها: در مطالعه حاضر، پایگاه داده هم بیانی ژن (COXPRESdb) با استفاده از کلیدواژهResponse to virus  جستجو شد. در نتیجه جستجو، مجموع ۲۱ ژن که در فرآیندهای بیولوژیکی پاسخ به ویروس در مرغ نقش دارند، معرفی شدند. از میان ۲۱ ژن معرفی شده، ۷ ژن در دو شبکه هم بیانی ژن مجزا حضور داشتند. با توسعه دو شبکه هم بیانی ژن، در نهایت ۱۴۸ ژن، در ۱۲ خوشه ژنی مجزا با هدف شناسایی سایر مولفه های هم بیانی ژنی، از پایگاه داده COXPRESdb شناسایی و استخراج شدند. جهت حاشیه‎ نویسی شبکه مورد مطالعه، داده بیانی سریGSE۵۳۹۳۲  از بخش GEO بانک اطلاعاتNCBI استخراج شد. تحلیل آماری و آنالیز بیان ژن ها توسط نرم ‎افزار GEO۲R انجام شد و ژن های با بیان افتراقی با ( ۰.۰۵> P) و (۲ > Log FC > ۲-) مشخص گردیدند. شبکه های فرعی توسط افزونه های MCODE،jActiveModules ۳.۱  و CytoCluster ۲.۱.۰با نرم افزار Cytoscape شناسایی شدند. پارامترهای MCODE شامل برش تعداد اتصال عضو: ۲، برش امتیاز عضو: ۰/۵،K-score : ۵ و حداکثر عمق: ۱۰۰ در نظر گرفته شدند. با استفاده از افزونه jActiveModules براساس داده های بیان واردشده به شبکه، زیرشبکه های بیانی فعال با درنظر گرفتن (adj.P < ۰.۰۱) شناسایی شدند. از افزونه CytoCluster جهت خوشه بندی شبکه براساس P-value برای شناسایی خوشه های معنی دار ( ۰.۰۵> P) استفاده شد. به‎ منظور محاسبه پارامترهای مرکزیت شامل پارامترهای بینابینی، نزدیکی و تعداد اتصال برای هر عضو و شناسایی ژن های اصلی (هاب ها)، از افزونه CentiScaPe ۲.۱ در شبکه استفاده شد. عبارات هستی شناسی ژن (GO) زیرشبکه ها و خوشه های شناسایی‎ شده با استفاده از ابزار حاشیه نویسی عملکردی DAVID بازیابی شدند. در نهایت، شبکه هستی شناسی ژن ها به‎ وسیله افزونه های ClueGO ۲.۵.۱۰ و CluePedia ۱.۵.۱۰ ترسیم شد. یافته‎ ها: از میان فهرست ۲۱ ژن پاسخ به ویروس ها در مرغ، هفت ژن در دو شبکه هم بیانی مجزا حضور داشتند. این دو شبکه هم بیانی شامل سه ژن TTR، ALB و RBP۴A و چهار ژن SAMHD۱، MX۱، IRF۷ و MYD۸۸ بودند. علاوه ‎بر ژن های حاشیه نویسی‎ شده در جریان پاسخ به ویروس در مرغ، فهرست ژنی حاوی ۱۴۸ ژن محتمل پاسخگو به ویروس با انحراف امتیاز هم بیانی در اطراف ۳ < Z، به‎عنوان هم بیانی بالاتر نسبت به توزیع نرمال هم بیانی تصادفی، از پایگاه داده هم بیانی ژن COXPRESdb استخراج شدند. بعد از تحلیل آماری داده های بیانی، شبکه تعاملی اولیه برای ژن ها با بیان افتراقی معنی دار به‎صورت ۶۱ عضو (پروتئین) و ۳۰۶ اتصال با استفاده از نرم افزار Cytoscape ایجاد شد. دو شبکه PPI توسط سه پروتئین PLAC۸L۱، LBFABP و IFI۶ به‎ هم مرتبط شدند. پروتئین هایSERPlNA۱۰  و AHSG با امتیاز عضو ۲۲ و PLG با امتیاز عضو ۲۱ به‎عنوان پروتئین های هاب (Hub)، دارای بیشترین میزان تعامل در کل شبکه پروتئین ها با بیان افتراقی بودند. محاسبه با افزونه MCODE منجربه شناسایی دو خوشه با چگالی بالا شد. این مناطق با چگالی بالا در شبکه ممکن است شامل پروتئین هایی باشند که به‎عنوان مجموعه ای در سلول عمل کنند. AMBP و DDX۶۰ به‎عنوان پروتئین های Seed به‎ ترتیب در خوشه شماره ۱ و ۲ حضور داشتند. پس از افزودن داده های بیان به عضو های شبکه در نرم افزار Cytoscape، محاسبه و خوشه بندی با استفاده از افزونه jActiveModules، پنج زیرشبکه بیانی فعال شناسایی شدند. دو خوشه ژنی معنی دار ( P< ۰.۰۵) با استفاده از افزونه CytoCluster ۲.۱.۰  (الگوریتم ClusterOne) با درنظر گرفتن مقدار (۰.۰۵ > P) شناسایی شدند. اولین خوشه معنی دار با ۲۵ عضو در سمت راست شبکه شامل پروتئین هایی بود که مسیر سیگنال دهی بیوسنتز فنیل آلانین، تیروزین و تریپتوفان را نشان دادند. دومین خوشه معنی دار با ۲۰ عضو در سمت چپ شبکه شامل پروتئین هایی بود که مسیر سیگنال دهی آنفولانزای A، عفونت ویروس هرپس سیمپلکس ۱ و مسیر سیگنال دهی گیرنده RIG-I را به‎عنوان مسیر درگیر در پاسخ ایمنی به ویروس نشان دادند. محاسبات شاخص های مرکزیت برای زیرشبکه های بیانی فعال حاصل از الگوریتم jActiveModules پس از افزودن داده های بیان و برای خوشه های حاصل از الگوریتم های MCODE قبل از افزودن داده های بیان نیز انجام شدند. در نهایت، پروتئین های IFIT۵،  IFIH۱وRSAD۲  در خوشه های به ‎دست آمده از الگوریتم MCODE (خوشه با بالاترین امتیاز) و CytoCluster و پروتئین IFIH۱ در زیرشبکه فعال بیانی به دست آمده از jActiveModules، دارای بالاترین امتیاز بینابینی، نزدیکی و تعداد اتصال عضو بودند. در بررسی غنی سازی ژنی KEGG، این سه پروتئین به ‎همراه چهار پروتئین STAT۱، EIF۲AK۲، TRIM۲۵ و دPLG به‎صورت معنی دار (۰.۰۵ > P) با مسیر سیگنال دهی آنفولانزای A، عفونت ویروس هرپس‎سیمپلکس ۱، بیوسنتز فنیل‎آلانین، تیروزین و تریپتوفان، متابولیسم فنیل آلانین و مسیر سیگنال دهی گیرنده RIG-I در پاسخ ایمنی به ویروس آنفولانزا در ارتباط بودند. نتیجه گیری: در نتیجه مطالعه حاضر ، پروتئین های IFIH۱، IFIT۵، و RSAD۲ با بالاترین امتیاز شاخص های مرکزیت برای خوشه ها و زیرشبکه های بیانی فعال و STAT۱، PLG، EIF۲AK۲، DHX۵۸ و TRIM۲۵ با بالاترین سطح معنی داری (P< ۰.۰۵) در مسیرهای سیگنال دهی انفولانزای A و مسیر سیگنال دهی گیرنده RIG-I در طیور به‎عنوان نشانگرهای زیستی پاسخگو به آنفولانزا معرفی شدند.

کلیدواژه ها:

Centrality index ، Gene co-expression ، Influenza ، KEGG ، Protein-protein interaction network ، آنفولانزا ، شاخص مرکزیت ، شبکه‎ تعاملی پروتئین-پروتئین ، هم بیانی ژن ، KEGG