بیان پروتئین آلفا-لاکتالبومین انسانی با استفاده از سازه کلروپلاستی در باکتری Escherichia coli

هدف: با افزایش تقاضای جهانی برای منابع پروتئینی با کیفیت بالا، تولید نوترکیب پروتئین های شیر انسانی به عنوان گزینه ای ایمن، مغذی و پایدار مورد توجه قرار گرفته است. این پژوهش با هدف طراحی و ارزیابی اولیه یک کاست بیانی کلروپلاستی حاوی ژن آلفا-لاکتالبومین انسانی در باکتری Escherichia coli به عنوان گام مقدماتی در مسیر تولید گیاهی این پروتئین انجام شد.مواد و روش ها: توالی رمزکننده آلفا-لاکتالبومین انسانی با کدون های ترجیحی کلروپلاست توتون بهینه سازی و در قالب یک کاست بیانی شامل راه انداز rrn، ناحیه ۵′UTR ژن ۱۰ فاژ ۷T و پایان دهنده rrnB طراحی گردید. این سازه در ناقل کلروپلاستی pPRV۱۱۱A همسانه سازی شد و با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز و برش آنزیمی، صحت ساختاری آن تایید شد. جهت ارزیابی کارایی ترجمه، پلاسمید نوترکیب به E. coli سویه BL۲۱ (DE۳) منتقل و القای بیان با IPTG انجام شد. پروتئین حاصل با روش کروماتوگرافی تمایلی بر پایه رزین نیکل تخلیص و پس از حذف برچسب هیستیدینی با آنزیم TEV، مجموعه HAMLET با اسید اولئیک تولید گردید. فعالیت زیستی این مجموعه با آزمون MTT روی رده سلولی WiDr ارزیابی شد.نتایج: پروتئین آلفا-لاکتالبومین انسانی با وزن تقریبی ۱۶ کیلو دالتون به صورت محلول در باکتری بیان شد. خالص سازی موثر پروتئین از بخش محلول سلولی و حذف موفق برچسب هیستیدینی، منجر به تولید پروتئینی با وزن نهایی حدود ۱۴ کیلو دالتون شد. آزمون های تاییدی شامل لکه گذاری وسترن و SDS-PAGE بیان موفق و خلوص بالای پروتئین را تایید کردند. مجموعه HAMLET تهیه شده با ترکیب این پروتئین و اسید اولئیک، در آزمون MTT موجب کاهش قابل توجه زنده مانی رده سلولی WiDr شد. به طور خاص، تیمار سلول ها با ۲۱ میکرومولار HAMLET باعث کاهش ۹۶ درصدی بقاء سلولی گردید، در حالی که تیمارهای جداگانه با آلفا-لاکتالبومین یا اسید اولئیک فاقد اثر معنی دار بودند. این نتایج نشان دادند که پروتئین تولیدشده نه تنها از نظر ساختاری صحیح است، بلکه ویژگی های عملکردی و زیستی مورد انتظار خود را نیز حفظ کرده است.نتیجه گیری: کاست بیانی طراحی شده دارای کارایی بالا در سیستم باکتریایی بوده و توانسته پروتئینی با فعالیت زیستی مطلوب تولید کند. این مطالعه شواهدی تجربی برای امکان سنجی استفاده از این سازه در تراریختی کلروپلاست گیاهان فراهم کرده و گامی موثر در مسیر تولید صنعتی آلفا-لاکتالبومین انسانی و ترکیبات زیست فعال مشتق از آن مانند HAMLET محسوب می شود.

کلیدواژه ها:

آلفا-لاکتالبومین انسانی ، بیان باکتریایی ، پروتئین وی ، ناقل کلروپلاستی