جداسازی، کلونینگ و تعیین توالی ژن آسپاراژیناز باکتری اروینیا کریزانتمی

ال- آسپاراژینازباکتریایی در درمان لوکمی لنفوبلاستیک حاد کودکان استفاده می شود. اگر چه بیشتر باکتریها حاوی ژن ال- آسپاراژیناز می باشند، اما تیپ دو این آنزیم فقط در بعضی از آنها دیده می شود. ال-آسپاراژیناز، ال-آسپاراژین را به ال-آسپارتات و آمونیوم هیدرولیز می کند. این آنزیم عمدتاً از اشرشیاکلی و گونه های مختلف اروینیا بدست می آید. علیرغم استفاده وسیع این آنزیمها اثرات جانبی نیز دارند. به این منظور می توان از ارگانیسمهای دیگری نیز این آنزیم را استخراج و اثرات دارویی آن را بررسی کرد. جداسازی آنزیم مذکور با منشاء اروینیا به منظور تولید دارو در داخل کشور تا کنون موفقیت آمیز نبوده است. لذا تصمیم گرفته شد تا مطالعات جداسازی، کلونینگ و تعیین توالی این آنزیم در ایران تکمیل گردد. هدف: در این تحقیق هدف جداسازی، کلونینگ، تعیین توالی ژن آسپاراژیناز اروینیا کریزانتمی بود. روش: بدین منظور سویه استاندارد باکتری اروینیا کریزانتمی از DSM آلمان تهیه شد، سپس DNA ژنومیک آن به کمک کیت استخراج DNA الگوی Roche استخراج گردید. سپس با استفاده از پرایمرهای مناسبی که به کمک نرم افزار الیگو طراحی شد کل این ژن توسط واکنش PCR، تکثیر گردید. در مرحله بعد، کل ژن با استفاده از کیت T/A کلونینگ درون وکتور pTZ57R/T الحاق گردید و درون سلول میزبان اشریشیاکلی سوش DH5 α ترانسفورم و پلاسمیدهای نوترکیب، به منظور تعیین توالی استخراج گردید. سپس توالی ژن مورد نظر توسط یک شرکت کره ای تعیین گردید و با توالی موجود در بانک ژن مقایسه شد. نتیجه: ژن جدا شده از سویه اروینیاکریزانتمی DSM4610 تفاوت های مشخصی با سایر ژنهای موجود در بانک ژن داشت و با شماره دسترسی JF972567 در بانک ژن ثبت شد.

کلیدواژه ها:

ال-آسپاراژیناز ، اروینیا کریزانتمی ، تعیین توالی ، T/A ، کلونینگ ، وکتور pTZ57R/T