بررسی الگوی بیان ژن های فارنسیل دی‎فسفات و اسکوآلن سنتاز تحت تاثیر اشعه گامای محیطی در گیاه درمنه کوهی

چکیده مبسوط مقدمه و هدف: درمنه کوهی (Artemisia absinthium) که معمولا با نام افسنطین شناخته می‎شود، یک گیاه دارویی بوته‎ای و چندساله مهم بومی آسیا، خاورمیانه، اروپا و شمال آفریقا است. در فرآیند تکامل، گیاهان مکانیسم هایی را توسعه داده اند که نه‎تنها تحت شدیدترین دزهای تشعشعات زنده می مانند، بلکه از طریق تنظیمات فیزیولوژیکی به تغییرات کوچک در شدت تشعشعات پاسخ موثری می دهند. یکی از مکانیسم‎های دفاعی گیاهان در برابر تشعشعات، تغییرات تکاملی در سطوح بیان ژن‎ها می‎باشد. از جمله این ژن‎ها، فارنسیل دی فسفات سنتاز (FDS)، آنزیم کلیدی مسیر متابولیکی ترپن‎ها است که سنتز ترکیبات سسکوئی ترپن از پیش ماده فارنسیل پیرو فسفات (FPP) را کاتالیز نموده و نقش مهمی در تنظیم رشد و نمو گیاهان ایفا می‎کند. در تحقیق حاضر اثرات پرتوهای حاصل از پسماندهای مواد رادیواکتیو در یک معدن متروکه اورانیوم بر روی تغییر بیان ژن‎های فارنسیل دی فسفات (FDS) و اسکوآلن سنتاز (SQS) در گیاه درمنه کوهی که به‎دلیل چندساله بودن، سالیان متمادی در محیط رادیواکتیویته محل نمونه‎برداری رشد یافته بود بررسی شد. مواد و روش‎ها: نمونه‎برداری مواد گیاهی از ارتفاعات روستای کوجنق واقع در هیجده کیلومتری شمال غربی شهرستان مشگین شهر با موقعیت جغرافیایی ۳۸° ۲۹' ۱۷.۷" N و ۴۷° ۳۰' ۱۵.۱" E انجام شد. کلیه محاسبات مربوط به موقعیت جغرافیایی با استفاده از دستگاه مکان‎یاب ماهواره‎ای گارمین (مدل اورگون ۶۵۰) صورت پذیرفت. برای دسترسی کامل به اطلاعات آلودگی تابشی منطقه مورد مطالعه، نقشه تشعشعات رادونی نقطه به نقطه در ۱۰ نقطه با استفاده از دستگاه تابش سنج Victoreen ۴۵۱ (Fluke biomedical company, USA) طی دو سال متمادی تهیه شد. این اندازه‎گیری‎ها مشتمل بر نقاط هم ارتفاع در دو کوه مقابل هم (کوه دارای نقاط حاوی مواد رادیواکیتو A و فاقد مواد رادیواکتیو B) بود. نمونه‎برداری از سرشاخه‎های گیاه درمنه کوهی (A. absinthium) به‎صورت سیستماتیک و در سه تکرار مختلف زیستی انجام پذیرفت. RNA کل از برگ های گیاهان نمونه‎برداری شده استخراج و رشته اول cDNA سنتز شد. برای طراحی آغازگرهای qPCR از نرم‎افزار آنلاین Primer ۳ Plus استفاده شد و سپس با ابزار Oligo analyzer و افزونه NCBI/Primer-BLAST در پایگاه ژنتیکی NCBI بررسی شدند. در مرحله اول، با به‎کارگیری cDNA سنتز شده برای تمامی نمونه‎های کنترل و غیرکنترل به‎عنوان الگو، نواحی ژنی کنترل کننده آنزیم‎های فارنسیل دی‎فسفات و اسکوآلن سنتاز برای اطمینان از صحت آغازگرهای طراحی شده تکثیر یافتند. بررسی کمی بیان ژن‎های مورد نظر به‎روش Real Time PCR با دستگاه (۳۰۰۰) Real Time PCR set Corbett و با به‎کارگیری کیت CyberGreen (شرکت سینا کلون) انجام شد. برای سنجش الگوی تغییر بیان ژن‎ها در تمامی cDNAهای سنتز شده از نمونه‎های مورد مطالعه از مستر میکس Ampliqon SYBR green Master Mix High ROX استفاده شد. یافته‎ها: آنالیز آماری داده‎ها با نرم‎افزار Graph Pad Prism ۱۰ نشان داد که سطح بیان هر دو ژن مورد بررسی در نمونه‎های جمع‎آوری شده از نقاط حاوی تشعشعات رادیواکتیو نسبت به نقاط فاقد تشعشعات رادیواکتیو بیشتر است. بیشترین افزایش نسبی بیان ژنی در ژن کنترل کننده اسکوآلن سنتاز مشاهده شد که این ژن از جمله ژن‎های کلیدی در مسیر بیوسنتزی گروه متابولیتی ایزوپرونوئیدها است. مقایسه آماری الگوی نسبی بیان ژن اسکوآلن (SQS) در نمونه‎های غیر رادیواکتیویته (Bsqs) و در نمونه‎های رادیواکتیویته (Asqs) نشان داد که بین میزان بیان ژن اسکوآلن سنتاز در نمونه ‎های جمع‎آوری شده از مناطق رادیواکتیو و غیر رادیواکتیو در سطح اطمینان ۹۹ درصد اختلاف معنی‎داری وجود دارد. هم‎چنین، آنالیز آماری الگوی نسبی بیان ژن فارنسیل دی فسفات (FDS) در نمونه‎های غیر رادیواکتیویته (Bfds) و نمونه‎های رادیواکتیویته (Afds) نشان داد که بین میزان بیان ژن فارنسیل دی فسفات در نمونه‎های جمع‎آوری شده از مناطق رادیواکتیو و غیر رادیواکتیو در سطح احتمال ۹۹ درصد اختلاف معنی‎داری باهم ندارند. علاوه بر این، مقدار ارزش p (p value) برای بیان نسبی ژن اسکوآلن سنتاز در نمونه‎های مناطق رادیواکتیو و غیر رادیواکتیو ۰/۰۰۷۷ و برای ژن فارنسیل دی فسفات مقدار ۰/۶۰۳۹ محاسبه گردید.  نتیجه‎گیری کلی: با توجه به اینکه میزان بیان ژن اسکوآلن سنتاز در ارتفاع ۹۰۰-۸۶۰ متر با متوسط شدت تشعشع (۰/۵۶۷ میلی‎سیورت)، در بالاترین مقدار خود بود که در ارتفاع ۹۳۰-۹۱۰ با بالاترین میزان تشعشع (۱/۲۵ میلی سیورت) میزان بیان ژن اسکوآلن افت شدیدی پیدا کرد. می‎توان استنباط نمود که بهینه شدت تشعشع برای تحریک بیان ژن اسکوآلن سنتاز در محدوده ۰/۵ میلی‎سیورت بوده و افزایش شدت تشعشعات منجر به کاهش شدید بیان این ژن می‎گردد و احتمالا با افزایش شدت تشعشعات و پرتوهای یونیزان، گیاه هوشمندانه فعالیت مسیر بیوسنتزی ماده اسکوآلن را تعدیل نموده و مسیر بیوسنتزی را به‎سمت سنتز سسکوئی‎ترپن‎ها که برای استفاده از پیش ماده مشترک فارنسیل دی فسفات با آنزیم اسکوآلن سنتاز در رقابت هستند، هدایت می‎نماید. با توجه به این‎که جهش‎زایی عناصر پرتوزا اثبات شده است، می‎توان نتیجه گرفت که قرار گرفتن طولانی‎مدت گیاهان چندساله در معرض تابش های رادیواکتیو منجر به ایجاد تغییرات ژنتیکی می‎شود. احتمالا این جهش‎ها با تغییر ساختمان و رفتار آنزیم‎های دخیل در مسیرهای بیوسنتز متابولیت های ثانویه، یک نوع واکنش محافظتی ژنتیکی- بیوشیمیایی گیاه برای مقابله با آسیب‎های عناصر رادیکال‎های آزاد ایجاد شده در اثر تشعشعات مواد پرتوزا می‎باشد.

کلیدواژه ها:

Artemisia absinthium ، Gene Expression ، Farnesyl Diphosphate ، Squalene Synthase ، اسکوآلن سنتاز ، بیان ژن ، تشعشعات رادیواکتیو ، درمنه کوهی ، فارنسیل دی فسفات