مطالعه امکان ارتباط مولکولی بین زنبور عسل و گیاه آفتابگردان از طریق انتقال بین گونه‎ ای RNA‎های کوچک

چکیده مبسوط مقدمه و هدف: زنبورعسل افزون بر تولید محصولات گوناگون مهمترین نقش خود را در طبیعت با دخالت در عمل گرده ‎افشانی و افزایش تولید محصولات کشاورزی و احیای محیط زیست ایفا می ‎کند، به‎ طوری‎که تقریبا یک سوم تولید منابع غذایی بشر مستقیم یا غیرمستقیم به گرده‎ افشانی حشرات (زنبورعسل در راس آنها) بستگی دارد. همچنین بررسی‎ ها نشان می‎ دهد که در کشورهای مختلف، نقش زنبورعسل در افزایش تولیدات کشاورزی ۶۹ تا ۱۴۳ برابر تولیدات مستقیم آن می‎ باشد. با گذشت بیش از یک دهه از شروع مطالعات مربوط به انتقال غذایی miRNAها بین موجودات مختلف و نقش تنظیمی آن‎ها در موجود میزبان، این بحث همچنان داغ و به‎ روز می ‎باشد. به‎ طوری‎که مطالعات محدودی در مورد نقش مصرف خوراکی miRNAها در زنبورعسل به‎ عنوان یک گرده‎ افشان مهم در صنعت کشاورزی و اکوسیستم طبیعی انجام شده است. امکان تنظیم بیان ژن بین گونه ‎های مختلف از طریق miRNAهای خوراکی، می ‎تواند سود ویژه ‎ای در رابطه متقابل گیاهان و گرده ‎افشان‎ های آن‎ها داشته باشد به ‎طوری‎که گیاهان می‎ توانند بیان ژن حشرات گرده ‎افشان را از طریق انتقال RNAهای کوچک کنترل کنند. به بیان دیگر، miRNAها نه‎ تنها بین سلول‎ ها و بافت ‎های یک ارگانیسم، بلکه بین گونه‎ های مختلف نیز قابلیت انتقال داشته و همچنان عملکرد تنظیمی خود را حفظ می‎ کنند. با توجه به نقش حیاتی زنبورعسل در گرده ‎افشانی گیاهان، این حشره می‎ تواند به ‎عنوان مدل بهتری در این زمینه مطرح شود. بدین‎ منظور، مطالعه حاضر که با هدف بررسی وجود ارتباط مولکولی بین این حشره مفید اجتماعی و گیاه میزبان از طریق انتقال غذایی miRNAهای با منشا خارجی بوده، می‎ تواند ابعاد جدید و گسترده‎ای از اثرات مفید این ارتباط را روشن کند. مواد و روش‎ ها: جمع ‎آوری گرده توسط تله گرده از کندوهای زنبورعسل واقع در مزرعه آفتابگردان در منطقه شال قزوین-ایران در روزهای اوج گلدهی گیاه مزبور انجام گرفت. گرده جمع ‎آوری شده بلافاصله از لحاظ مورفولوژیکی بررسی و به‎ منظور حفظ تازگی و جلوگیری از تخریب RNA، به تانک ازت مایع منتقل شد. به‎ منظور انجام آزمایشات تغذیه‎ ای از چهار عدد کندو برای جمع آوری زنبور پرستار و تغذیه تحت شرایط کنترل شده استفاده شد. بدین‎ ترتیب حدود صد عدد زنبور جوان از هرکدام از کندوها به داخل قفس های مخصوص طراحی شده، منتقل شد. دو عدد از قفس ها به‎ عنوان شاهد (تغذیه با شربت شکر) و دو قفس به ‎عنوان تیمار تغذیه شده با گرده آفتابگردان در نظر گرفته شد. همچنین برای برقراری شرایط طبیعی کندو (فرمون ملکه، دما و رطوبت) در حین آزمایش، قفس‎ه ای حاوی زنبورهای پرستار در طبقه بالای کندو قرار داده شد. به‎ منظور شستشوی دستگاه گوارش زنبور، همه تیمارها به ‎مدت ۴۸ ساعت با شربت شکر تغذیه شده، بعد از آن برای تشویق تغذیه بعدی حدود ۳ ساعت زنبورها گرسنه نگه داشته شدند و در ۲۴ ساعت بعدی تیمار شاهد همچنان با شربت شکر و تیمار بعدی با محلول ۳۰ درصد شکر و ۷۰ درصد گرده آفتابگردان تغذیه شد. بعد از اتمام آزمایشات تغذیه‎ ای، زنبوران با استفاده از سرما بیهوش شده و بافت روده میانی آن‎ها جمع ‎آوری و در ترایزول هموژنیزه شده و در دمای منفی هشتاد درجه سانتی ‎گراد تا زمان استخراج ذخیره گردید. استخراج RNA از گرده و بافت روده میانی زنبورعسل با استفاده از کیت miRNeasy mini Kit از شرکت کیاژن انجام گرفت و نمونه ‎ها برای توالی‎ یابی به شرکت Novogene بیجینگ چین فرستاده شد. بعد از توالی ‎یابی موفیت ‎آمیز Small RNA-Seq، با استفاده از آنالیزهای بیوانفورماتیکی، miRNAهای گرده آفتابگردان شناسایی و ردیابی آن‎ها در زنبورهای گروه‎های مختلف تغذیه شده انجام گرفت. در گام بعد، از تکنیک RT-qPCR برای تایید نتایج حاصل از آنالیز بیوانفورماتیکی، استفاده شد. یافته ‎ها: نتایج آنالیز بیوانفورماتیکی حاکی از ردیابی یازده miRNAی گیاهی (miR-۱۴۸a، miR-۲۶a، miR-۲۱-۵p، miR-۱۴۳، miR-۲۷a، miR-۲۰۳، let-۷g، miR-۱۲۶، miR-۳۰d، miR-۱۰۱ و miR-۱۰۳) در زنبوران تغذیه شده با گرده آفتابگردان بود در حالی‎که در زنبوران گروه کنترل هیچ miRNA گیاهی یافت نشد. برای راستی آزمایی نتایج حاصل از آنالیز بیوانفورماتیکی، به‎ طور تصادفی الگوی بیان چهار مورد از miRNAهای منتقل شده (let-۷g، miR-۲۱-۵p، miR-۱۲۶ و۱۴۸ miR-) با روش RT-qPCR تایید شد که نشانگر نقش احتمالی miRNAهای گیاهی ردیابی شده در تنظیم بیان ژن زنبورعسل می‎ باشد. نتیجه‎ گیری: این یافته ها شواهد قانع کننده ای را برای انتقال موفق میکروRNAها (miRNAها) از گیاه میزبان به بدن زنبورهای عسل از طریق رژیم غذایی ارائه می دهند. این پدیده به ارتباطات پیچیده بین زنبورهای عسل و گیاهانی که گرده افشانی می کنند، تاکید می کند و نقش حیاتی زنبورهای عسل در حفظ سلامت اکوسیستم و تولیدات کشاورزی را برجسته می سازد. بحث جاری درباره انتقال رژیمی ‎miRNAهای گیاهی در گونه های مختلف، پتانسیل نقش های تنظیمی آن ها در تاثیرگذاری بر بیان ژن در موجودات میزبان را نشان می دهد. کشف یک رابطه مولکولی بین زنبورهای عسل و گیاهان میزبان از طریق miRNAها، راه های جدیدی را برای درک تعاملات پیچیده ای که در اکوسیستم ها رخ می دهد، به‎ ویژه بین حشرات گرده افشان و گیاهان گلدار، باز می کند. با پیشرفت بیشتر در ابعاد گسترده این رابطه مولکولی، به طور فزاینده ای روشن می شود که این تعاملات می توانند به عنوان یک نقشه راه برای مطالعات آینده عمل کنند. چنین تحقیقاتی می تواند بر روی افزایش تولید کندو از طریق پرورش انتخابی گیاهانی که مزایای تغذیه ای و ژنتیکی را برای زنبورهای عسل بهینه می کنند، متمرکز شود. علاوه بر این، درک اینکه چگونه این miRNAهای منتقل شده بر سیستم ایمنی زنبورهای عسل تاثیر می گذارند، ممکن است منجر به توسعه استراتژی های بهبودی برای مقاومت در برابر بیماری ها شود که در نهایت به نفع هر دو جمعیت زنبور و شیوه های کشاورزی وابسته به خدمات گرده افشانی آن ها خواهد بود.

کلیدواژه ها:

Diet-derived transmission of MicroRNAs ، Honey bees ، RT-qPCR ، Sunflower pollen ، انتقال غذایی miRNA ، زنبورعسل ، گرده آفتابگردان ، RT-qPCR