شناسایی چندشکلی‎ های تک نوکلئوتیدی در ژن‎ های B۳GAT۲، CPQ و HPSE در بافت کبد جوجه های گوشتی نژاد آرین مبتلا به آسیت با استفاده از داده‎ های RNA-seq

چکیده مبسوط مقدمه و هدف: جوجه‎های گوشتی یکی از منابع مهم و استراتژیک در تامین گوشت کشور به‎شمار می‎روند. مبدا اصلی این صنعت حیاتی مرغ لاین است که تنها چند کشور از آن بهره‎مند هستند. ایران یکی از کشورهایی است که دارای لاین مرغ گوشتی است که آرین نام دارد. اما این لاین به‎دلیل بروز برخی مشکلات از جمله بالا بودن نرخ مرگ و میر به‎علت سندرم آسیت نتوانسته در جلب رضایت مشتری موفق باشد. سندرم آسیت یکی از مهم‎ترین عوامل مرگ و میر و ضرر و زیان در صنعت طیور به‎شمار می‎رود. بنابراین، توجه به یک راه‎حل پایدار در کاهش این بیماری در مزارع پرورش جوجه‎های گوشتی کشور ضروری به‎نظر می‎رسد. این سندرم بافت‎های مختلفی را درگیر می‎کند، یکی از بافت‎های مهم کبد است که نقش اصلی را در تنظیم متابولیسم در کل بدن ایفا می‎کند. راه‎حل پایدار در کاهش این سندرم در مزارع جوجه‎های گوشتی ایجاد لاین‎های مقاوم به سندرم آسیت از طریق اصلاح نژاد می‎باشد. هدف از این مطالعه شناسایی چندشکلی‎های تک نوکلئوتیدی ژن‎های CPQ، B۳AGT۲ و HPSE در بافت کبد جوجه‎های گوشتی آرین مبتلا به سندرم آسیت با استفاده از داده‎های RNA-seq بوده است. مواد و روش‎ها: این پژوهش در دو فاز شامل فاز اول (القاء آسیت) و فاز دوم (شرایط پرورش نرمال) انجام شد. در فاز اول ۸۱۷ قطعه جوجه یک‎ روزه از ۷۱ خانواده ناتنی پدری از خط B آرین که در روز اول تعیین جنسیت و شماره‎زنی شده بودند، از مرغ لاین آرین واقع در مزارع بابل‎کنار استان مازندران تهیه و در ایستگاه پرورش طیور خلعت پوشان دانشگاه تبریز پرورش داده شدند. پرندگانی که علائم آسیت را نشان دادند در دسته حساس به آسیت و بقیه پرندگان در گروه سالم طبقه‎بندی شدند. استخراج RNAی کل از تعداد ۳۲ پرنده شامل ۱۶ پرنده سالم (۸ پرنده نر و ۸ پرنده ماده) و ۱۶ پرنده بیمار (۸ پرنده نر و ۸ پرنده ماده) ‎به‎صورت انفرادی از بافت کبد انجام شد. مقدار مساوی از RNA ۴ پرنده با یکدیگر ادغام شده و در مجموع ۸ نمونه ادغام شده به‎دست آمد که ۴ نمونه مربوط به پرندگان سالم و ۴ نمونه دیگر مربوط به پرندگان آسیتی بود. پس از استخراج RNA، کمیت و کیفیت RNA استخراج شده توسط نانودراپ مدل UV-۱۸۰۰/SHIMMADZU و ژل آگارز ۱/۵ ‎درصد سنجیده شد. سپس RNA استخراج شده توسط DNase تیمار و خالص‎سازی گردید. تعیین توالی نمونه‎ها با استفاده از فن‎آوری توالی‎یابی ایلومینا انجام گرفت. کنترل کیفیت خوانش‎ها با استفاده از نرم‎افزار FastQC انجام و هم‎ردیفی خوانش‎ها با استفاده از نرم‎افزار STAR انجام گرفت. بعد از هم‎ترازی توالی‎ها با ژنوم مرجع از ابزارهای فراهم شده در دو مجموعه نرم‎افزاری Picard tools و gatk به‎منظور شناسایی واریانت‎های موجود در هر نمونه استفاده شد. یافته‎ها: تمامی شاخص‎های کنترل کیفیت نرم‎افزار FASTQC نشان دهنده‎ کیفیت مناسب داده‎های مورد مطالعه بود. پس از کنترل کیفیت، داده‎های RNA-seq بافت کبد روی ژنوم مرجع مکان‎یابی شدند. حدود ۹۰ درصد از خوانش‎ها روی ژنوم مرجع مکان‎یابی شدند که این میزان نشان دهنده‎ کیفیت بالای هم‎ردیفی داده‎های توالی‎یابی شده نسبت به ژنوم مرجع است. براساس یافته‎های پیشین، در این مطالعه ژن CPQ به‎عنوان ژن مهم و مرتبط با آسیت در نظر گرفته شد. برای درک کامل اهمیت این ژن در فنوتیپ‎های مرتبط با بیماری، درک شبکه ژنی و برهم‎کنش پروتئین با پروتئین‎های شبکه پروتئینی این ژن براساس STRING ترسیم گردید. هستی‎شناسی (GO) ۴۹ ژن که براساس string با هم در ارتباط بودند، در نرم‎افزار DAVID انجام شد و مشخص شد که ژن‎های CPQ، HPSE و B۳GAT۲ در مسیرهای بیولوژیکی مهمی که با بیماری آسیت مرتبط است، نقش دارند. از بین ژن‎های مرتبط با ژنCPQ  دو ژن B۳GAT۲ و HPSE که با آسیت نیز مرتبط بودند و دارای SNP در نمونه‎های مبتلا به آسیت بودند انتخاب گردید و مورد مطالعه قرار گرفتند. سپس ژن‎های مرتبط با ژن CPQ دو ژن B۳GAT۲ و HPSE که با آسیت نیز مرتبط بودند و دارای SNP در نمونه‎های مبتلا به آسیت بودند انتخاب گردیده و مورد مطالعه قرار گرفتند. در این پژوهش در ژن CPQ در نمونه‎های مبتلا به آسیت تعداد ۸ و در نمونه‎های سالم تعداد ۳ چندشکلی تک‎نوکلئوتیدی شناسایی شد که برای اولین‎بار در این پژوهش شناسایی و گزارش شده‎اند. ژن CPQ برجسته‎ترین ژن کاندید آسیت است که تا به‎امروز شناسایی شده است، که می‎تواند در فرایند انتخاب به‎کمک نشانگر برای افزایش مقاومت به آسیت در برنامه‎های اصلاح نژادی مورد استفاده قرار گیرد. همچنین در ژن‎های HPSE و B۳GAT۲ در نمونه‎های مبتلا به آسیت به‎ترتیب تعداد ۴ و ۱ چندشکلی تک‎نوکلئوتیدی شناسایی شد. اما برای این ژن‎ها در نمونه‎های سالم چندشکلی تکنوکلئوتیدی یافت نشد. هپاراناز (HPSE) یک اندوگلیکوزیداز است که برش زنجیره‎های جانبی پروتئوگلیکان‎های هپاران سولفات را کاتالیز می‎کند. بنابراین در بازسازی ماتریکس خارج سلولی و غشاهای پایه و همچنین آزادسازی مولکول‎های مختلف مرتبط با هپاران سولفات به‎عنوان فاکتورهای رشد، سیتوکین‎ها و آنزیم‎ها نقش دارد. نتیجه‎گیری: از چندشکلی‎های شناسایی شده در این پژوهش با بررسی بیشتر و تایید تاثیر آن‎ها بر آسیت می‎توان برای انتخاب لاین‎های جوجه‎های گوشتی مقاوم به سندرم آسیت در برنامه‎های اصلاح نژادی استفاده کرد.

کلیدواژه ها:

RNA-seq ، Ascites ، Marker-assisted selection ، Broiler ، Single-nucleotide polymorphism ، آسیت ، انتخاب به‎ کمک نشانگر ، جوجه گوشتی ، چندشکلی تک نوکلئوتیدی ، RNA-seq