پویش ژنومی برپایه آنالیز مسیر مرتبط با صفت بال فرشته ‎ای در اردک ‎های نژاد پیکین با استفاده از داده‎ های توالی ‎یابی کل ژنوم

چکیده مبسوط مقدمه و هدف: بال فرشته یک بدشکلی توسعه یافته بال است که می ‎تواند بر پرورش و تولیدمثل در گله‎ های تجاری اردک تاثیر گذار باشد. از این‎ رو مطالعه تنوع ژنتیکی و شناسایی مناطق ژنومی موثر بر صفت بال فرشته ‎ای در جمعیت‎ های اردک، امری ضروری در این گونه محسوب می ‎شود. در این راستا، ابزارهای قدرتمندی مانند نسل جدید توالی‎ یابی امکان رمزگشایی اطلاعات کل ژنوم در این گونه را فراهم آورده است. به‎ طور معمول در مطالعات پویش کل ژنومی در نظر گرفتن تصحیحات سختگیرانه برای جلوگیری از نتایج مثبت کاذب ضروری می‎ باشد، ولی اعمال این نوع تصحیحات موجب از دست رفتن نشانگرهای SNP با اثر کوچکتر موثر بر صفات کمی می‎ گردد که نتیجه آن شناسایی SNP‎هایی می‎ گردد که تنها بخش کوچکی از تنوع ژنتیکی صفت را نشان می‎ دهد و از این‎ رو در اکثر مواقع بخش عمده واریانس ژنتیکی پنهان باقی می‎ ماند. یکی از روش‎ های جایگزین استفاده از آنالیزهای غنی‎ سازی مجموعه‎ های ژنی می‎ باشد. در این روش ارتباط بین صفت مورد مطالعه و نشانگرهای ژنتیکی را در یک دسته یا گروه ژنی که به‎ طور عملکردی با هم مرتبط هستند بررسی می‎ کند. در حقیقت در این روش به‎ دنبال ژن‎ هایی هستیم که به ‎تنهایی اثر آنها بر صفت مورد نظر معنی‎ دار نشده، ولی اثر تجمعی آنها روی صفت دارای اثر معنی ‎دار است. علاوه براین، یکی از دلایل اصلی آنالیز غنی ‎سازی مجموعه‎ های ژنی تعداد کم بودن SNPهای معنی ‎دار می ‎باشد که موجب عدم شناسایی مناطق ژنومی مرتبط با صفات مهم اقتصادی می‎ گردد. در نتیجه روش پویش ژنومی بر مبنای مسیر کارآیی بهتری برای یافتن مناطق ژنومی، درک بهتر مکانیسم و معماری ژنتیکی را دارا می ‎باشد. بنابراین، هدف از پژوهش حاضر شناسایی مناظق ژنومی و ژن‎ های کاندیدای مرتبط با صفت بال فرشته‎ ای در اردک با استفاده از پویش کل ژنوم بر پایه آنالیز مسیر می‎ باشد. مواد و روش ‎ها: بدین‎ منظور از اطلاعات داده ژنوم توالی‎ یابی شده ۶۳ قطعه اردک شامل ۳۰ قطعه دارای بال نرمال (شاهد) و ۳۳ قطعه دارای بال فرشته‎ ای (موردی) استفاده شد. توالی ‎یابی کل ژنوم توسط شرکت ایلومینا Hiseq ۴۰۰۰ انجام شده بود. ابتدا نشانگرهای SNP شناسایی شده از ایندل جدا شدند و با استفاده از برنامه GATK فیلتر شدند. سپس با استفاده از برنامه PLINK، SNPهای دو آللی با حداقل فراوانی آللی بزرگتر یا مساوی با ۰/۰۱ که حداقل در ۹۵ درصد افراد دارای ژنوتیپ مشخص بودند، حفظ شده و مابقی حذف شدند. که در نهایت ۱۴۰۶۴۹۸۴ نشانگر SNP بعد از مراحل مختلف کنترل کیفیت باقی ماندند. در گام بعدی برای شناسایی SNP‎های مستقل از نرم ‎افزارPLINK  استفاده شد. برای این‎ منظور با حذف SNPهایی که در حالت عدم تعادل پیوستگی بالایی با یکدیگر قرار داشتند، در پنجره ‎هایی شامل SNP ۵۰ و با حرکت SNP ۵ رو به ‎جلو در هر مرحله، SNPهای دارای r۲ (معیار عدم تعادل پیوستگی) بیش از ۰/۲ (دستور --indep-pairwise ۵۰ ۵ ۰.۲) با یکدیگر از مجموعه داده ‎ها حذف شدند. در نهایت بعد از کنترل کیفیت تعداد ۶۸۶۴۴۹ SNP برای آنالیزهای پویش کل ژنومی بر پایه تجزیه و تحلیل غنی‎ سازی مجموعه ژنی باقی ماندند. اساسا آنالیز پویش ژنومی بر پایه تجزیه و تحلیل مجموعه ‎های ژنی در سه مرحله انجام می ‎گردد: ۱) تعیین مکان SNPهای معنی‎ دار با ژن ۲) ارتباط ژن‎ ها به طبقات عملکردی و مسیرهای زیستی ۳) پویش کل ژنومی بر پایه آنالیز مسیر. ۱- تعیین مکان SNPها با ژن‎ ها: SNPهایی که مقدار P-value آنها کمتر از ۰/۰۰۵ بود با استفاده از بسته نرم ‎افزاری biomaRt۲ در محیط R و با استفاده از رفرانس ژنومی اردک (CAU_duck۱.۰) به ژن‎ هایی که نشانگر SNP موردنظر در داخل آن ژن و یا kb ۱۵ بالادست یا پایین‎ دست آن ژن قرار داشت، ارتباط داده شدند. ۲- ارتباط ژن‎ ها به طبقات عملکردی و مسیرهای بیوشیمیایی: جهت تعیین طبقات عملکردی ژنی و مسیرهای متابولیکی و تنظیمی ژن‎ های معنی‎ دار از ۵ پایگاه ‎های اطلاعاتی شامل هستی‎ شناسی ژن (http://www.geneontology.org/GO, )، مسیرهای بیوشیمیایی (http://www.genome.jp/kegg/KEGG, )، Panther (http://www.pantherdb.org)، Metacyc (http://www.metacyc.org) و Reactome (http://www.reactome.org) جهت تعیین طبقات عملکردی و مسیرهای بیوشیمیایی استفاده گردید. ۳- پویش کل ژنومی بر پایه آنالیز مسیر: ارتباط‎ های معنی‎ دار مسیرهای عملکردی با صفت با فرشته‎ ای با استفاده از توزیع فوق هندسی و آماره Fisher’s exact test مورد آزمون قرار گرفت. یافته ‎ها: نتایج آنالیز PCA نشان داد که با PC۱ گروه جمعیت سالم و PC۲ گروه جمعیت بیمار را به ‎خوبی از یکدیگر تفکیک و جدا کردند. در این پژوهش نشانگرهای تک نوکلئوتیدی واقع روی کروموزوم‎ های ۱، ۲، ۳، ۶، ۸، ۱۱، ۱۸، ۲۰، ۲۷ و ۳۱ شناسایی شدند که با ژن ‎های ATP۱۱A، UBE۲E۲، ITPR۲، GUCA۱C،ATP۲C۱، PLCG۱ و BMPR۱A مرتبط بودند. در تفسیر مجموعه ژنی، تعداد ۲۱ مسیر هستی ‎شناسی ژنی و بیوشیمیایی با صفت بال فرشته ‎ای شناسایی شد (۰/۰۵P˂). از این بین، مسیرهای skeletal muscle myosin thick filament assembly، response to calcium ion،wing disc morphogenesis و Calcium signaling pathway عملکرد های مهمی را در ارتباط با رشد و توسعه‎ ی عضلات اسکلتی، پاسخ به یون کلسیم، رشد و توسعه استخوان، حجم مواد معدنی استخوان و فعال‎ سازی مسیر سیگنال‎ دهی کلسیم بر عهده داشتند نتیجه ‎گیری: با توجه به نقش کلیدی و موثر ژن‎ های کاندیدای شناسایی شده بر صفت بال فرشته‎ ای در این تحقیق، در صورت تایید به‎ وسیله مطالعات تکمیلی می‎ توان از آنها در انتخاب ژنتیکی گله ­های تجاری اردک مورد استفاده قرار گیرند.

کلیدواژه ها:

Duck ، Enrichment analysis ، Genomic data ، Next generation sequencing ، Wing deformity                     ، آنالیز غنی‎ سازی ، اردک ، بدشکلی بال ، توالی‎ یابی نسل بعد ، داده‎ های ژنومی ​​​​​​​