تعیین مقدار اکراتوکسین A در قهوه سبز و بوداده عرضه شده در بازار با استفاده از روشکروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا ( ( HPLC

مقدمه : پیشرفت علم و دانش و افزایش آگاهی در زمینه آلاینده های طبیعی و مصنوعی مواد غذایی باعث توجه مصرف کنندگان به کیفیت و سلامت مواد غذایی شده است . بسیاری از محصولات کشاورزی به ویژه غلات در معرض آلودگی در مزرعه و یا حین ذخیرهسازی قرار دارند. یکی از انواع قارچهای آلودهکننده موادغذایی با عنوان مایکوتوکسین ها شناخته می شوند. اکراتوکسین ها یکی از انواع مایکوتوکسین ها هستند که متابولیت ثانویه قارچهای آسپرژیلوس و پنیسیلیوم محسوب می شوند. اکراتوکسین سه نوع A، B و C دارد که تفاوت اندکی در ساختار شیمیایی و در نتیجه اثرات سمی دارند. رایج ترین ، فراوان ترین و سمی ترین عضو اکرتوکسین ها، اکراتوکسین (OTA) A است . OTA در سطح مولکولی به طور رقابتی مانع از عمل آنزیم فنیل آلانین -tRNA سنتتاز می شود. این آنزیم برای مراحل آغازین پروتئین سازی نیاز است و OTA باعث اختلال در سنتز DNA، RNA و پروتئین ها می شود. برای OTA اثرات مضر بسیاری مانند نفروتوکسیسیتی ، سمیت کبدی و سرطان زایی گزارش شده است . آژانس بین المللی تحقیقات سرطان IARC آن را در گروه B۲ (عامل سرطانزای احتمالی ) برای انسان طبقه بندی کرده است . OTA خاصیت بالقوه نفروتوکسیک و نفروکارسینوژن دارد . آلودگی محصولات کشاورزی مختلفی از جمله غلات، جو، حبوبات، برنج ، قهوه و حتی گوشت و نوشیدنی و میوههای خشک به OTA گزارش شده است . اتحادیه اروپا (EU) حد مجاز OTA را در چندین مواد غذایی در محدوده μg/kg ۱۰-۵.۰ تعیین کرده است . OTA در دانه های قهوه طی فرآیندهای غذایی مانند پخت و پز، تخمیر و بو دادن پایدار می ماند. گزارش شده است ۱۲ درصد از کل OTA دریافتی در انسانها از طریق قهوه است . طبق استاندارد ملی ایران حد مجاز OTA در انواع دانه بو داده و پودر قهوه ppb ۵ و انواع قهوه فوری و پودر مخلوط قهوه فوری ppb ۱۰ و انواع دانه قهوه سبز ppb ۱۵ تعیین شده است . با توجه به افزایش مصرف قهوه در ایران، میزان OTA به عنوان یک ماده آلاینده در قهوه و خطرات احتمالی آن برای سلامتی انسان باید مورد بررسی قرار گیرد. هدف از این مطالعه اعتبار سنجی و بهینه سازی روش علمی برای اندازه گیری OTA در قهوه با استفاده از دستگاه HPLC و همچنین تعیین مقدار OTA و بررسی میزان آلودگی در نمونه های قهوه بوداده و سبز در سطح عرضه می باشد.روش کار: در این مطالعه تعداد ۲۷ نمونه دانه قهوه سبز و قهوه بو داده از سطح عرضه با برندهای مختلف به روش تصادفی جمع آوری شد. استخراج OTA از نمونه های قهوه با استفاده از NaCl، متانول و آب انجام شد. عصاره حاصل ، از ستون ایمونوافینیتی مخصوص OTA توسط دستگاه منیفلد خلا عبور داده شد و پس از تغلیظ نمونه به دستگاه HPLC تزریق شد. سپس نتایج حاصل از آنالیز مورد بررسی قرار گرفت و میزان OTA محاسبه و نتایج گزارش شد. از سیستم ایزوکراتیک آب و استونیتریل با ستون ۱۸C برای ارزیابی نمونه ها استفاده شد. شناسایی OTA با دتکتور فلورسانس در طول موج تحریک ۳۳۳ نانومتر و طول موج نشر ۴۶۰ نانومتر انجام شد. به منظور اعتبار بخشی روش کروماتوگرافی و اطمینان از آنالیز مناسب نمونه و ارائه بهترین نتایج ؛ انتخابی بودن، خطی بودن، تعیین حد تشخیص ، تعیین حد قابل محاسبه دقت و صحت بررسی شد. نتایج : اهمیت اعتبار سنجی اثبات قابل اعتماد بودن نتایج ، دقیق بودن و قابلیت تکرار نتایج است . در این مطالعه نیز فاکتورهای مورد نیاز اعتبارسنجی بررسی و گزارش شده است . ماتریکس قهوه به علت پیچیدگی و وجود عوامل مداخله گر نیاز به چندین مرحله آماده سازی و استخراج دارد. این مراحل مهم ترین بخش آنالیز از نظر منبع تغییر دهنده نتایج در نظر گرفته می شود. به همین علت طراحی یک روش آنالیز تکرارپذیر و مطمئن و دقیق در استخراج، ضروری است . معتبرسازی روش با بررسی اختصاصی بودن، خطی بودن، دقت ، صحت و حساسیت انجام شد. جهت بررسی اختصاصی بودن، از مقایسه کروماتوگرام های استاندارد OTA با نمونه بلانک استخراج شده از قهوه استفاده شد. در نمونه های بلانک قهوه هیچ پیک تداخلی مشاهده نشد که این نکته نشان دهنده این مطلب بود که روش آنالیز منتخب برای آنالیز OTAکاملا اختصاصی است . از طرفی ارزیابی میزان بازیابی باعث اطمینان از عدم تداخل ماتریکس نمونه بر تشخیص OTA می شود. بر اساس محاسبات انجام شده میزان بازیابی در محدوده ۳.۱۰۱ تا ۳.۱۰۴ درصد برای ۳ سطح غلظتی OTA در نمونه های آزمایش شده حاصل شد. نتایج خطی بودن بر اساس منحنی استاندارد و ضریب همبستگی ۹۹۹۹.۰ محاسبه شد. کمترین حد قابل ردیابی (ppb (LOD۰۴۶.۰ و کمترین حد قابل محاسبه ppb (LOQ) ۱۳۸.۰ محاسبه گردید. با توجه به نتایج اعتبار سنجی ، روش آنالیز انجام شده در این مطالعه برای شناسایی و تعیین مقدار OTA در دانه های قهوه سبز و بو داده مناسب بود. میانگین مقدار OTA در ۲۷ نمونه قهوه سبز و قهوه بو داده ppb ۲۵.۱±۶۵.۱ مشخص شد. با توجه به مقادیر مجاز OTA در استاندارد ملی ؛ تمامی نمونه های قهوه در محدوده مجاز OTA بودند و فقط یکی از آنها غلظت بالاتر از حد مجاز را نشان داد. میزان آلودگی در یک نمونه از قهوه بوداده شده بیش از حد مجاز و برابر با ppb ۲۳.۱±۴۶.۵ محاسبه شد.نتیجه گیری : احتمال دریافت بیش از حد OTA برای کسانی که زیاد قهوه می نوشند، می تواند تهدیدی جدی باشد. تولید قهوه بر اساس روشهای مناسب و رعایت استانداردهای بهداشتی به شدت توصیه می شود تا خطر آلودگی کاهش یابد. با وجود اینکه در کشور ما نیز طرفداران نوشیدنی انواع قهوه در حال افزایش است و طبق آمار اتاق بازرگانی در سال ۱۳۹۷ واردات انواع قهوه بیش از ۱۰۵۰۰تن گزارش شده است ، اما آمار دقیقی از میزان مصرف سرانه قهوه در ایران وجود ندارد. همچنین با بررسی های انجام شده تا کنون مطالعه ای در زمینه تعیین مقدارOTA در انواع قهوه در ایران انجام نشده است . هر چند ایران جزو کشورهای تولید کننده قهوه نمی باشد اما با توجه به افزایش مصرف آن نیاز است که محموله های وارداتی قبل از توزیع در سطح عرضه ، تحت نظارت و با انجام آزمون های مربوطه کنترل شوند. همچنین احتمال آلودگی پس از واردات محصول با وجود شرایط نامطلوب انبارداری و نگهداری در مکان های نامناسب نیز وجود دارد.

کلیدواژه ها:

اکراتوکسین A ، قهوه ، HPLC ، مایکوتوکسین