شناسایی عملکرد پپتید ضدمیکروبی استخراج شده از همولنف سوسک Tenebrio molitor

پپتیدهای ضدمیکروبی حشرات، متعلق به سیستم ایمنی ذاتی است که در توده چربی آنها تولید و به درون همولنف ترشح میشوند. هدف از این پژوهش جداسازی و تخلیص پروتئین مورد نظر از همولنف و بررسی دامنه عملکردن پپتید میباشد. برای افزایش میزان تحریک سیستم ایمنی حشرات و افزایش بیان پپتیدهای ضدمیکروبی، سوسپانسیون باکتری (ATCC۲۵۹۲۲) Escherichia coli با غلظت ۱۰۸ cfu/ml به مدت ۲۰ دقیقه جوشانیده، و پس از دوبار شستوشو با بافر PBS، از این سوسپانسیون به ۳۰ لارو Tenebrio molitor، هر لارو غلظتی معادل ۱۰۵ cfu/ml و همان حجم بافر به ۱۰ لارو به عنوان کنترل PBS باکمک سرنگ G۳۰ تلقیح گردید، در زمان تزریق و هنگام استخراج همولنف، لاروها به وسیله سرما و اتر غیرفعال شدند، ۱۸ و ۳۲ ساعت پس از تزریق با جداسازی سر حشرات، همولنف در تیوبهای سرد حاوی بافر ضدانعقاد استخراج شد. پس از سانتریفیوژ و رسوب گیری در شرایط ۱۰۰۰۰rpm، دمای ۴ درجه سانتیگراد، به مدت۳۰ دقیقه ۳) تا ۴ بار) همولنف از سایر اجزای سلول جدا شده و با استفاده از SDS-PAGE ۱۲% الگوی پروتئینهای موجود در همولنف حشرات آلوده با کنترل مقایسه گردید. برای بررسی ماهیت ضدباکتریایی همولنف با روش انتشار در آگار، ۵۰ ʽl همولنف حشرات کنترل و آلوده در درون چاهک با قطر ۵ میلیمتر برروی پلیت نوترینت آگار حاوی E. coli ۱۰۵ cfu/ml و Staphylococcus aureus (ATCC۲۵۹۲۳) افزوده و قطر هاله عدم رشد پس از ۱۴ ساعت گرماگذاری، اندازگیری شد. تفاوت در میزان قطر باند ۳۰ kDa نسبت به کنترل پس از ۳۲ ساعت آلودگی مشاهده شد. قطر هاله عدم رشد برای هر دو باکتری در حدود ۱۴ میلی متر نسبت به کنترل تزریق (PBS) افزایش داشت. مراحل تخلیص و جداسازی هر پروتئین از مجموعه پروتئینها با هدف مقایسه این عملکرد در حشرات بومی سمنان در حال اجرا میباشد.

کلیدواژه ها:

پپتید های ضدمیکروبی ، Tenebrio molitor ، همولنف