بررسی مکان یابی ژن های مقاومت و تهیه گندم مقاوم به بلایت فوزاریومی با استفاده از نشانگرهای دی.ان.ا

بلایت فوزاریومی سنبله ‭(FHB) ‬که توسط گونه های مختلف قارچ فوزاریوم ‭(Fusarium spp.) ‬ایجاد می شود، یک بیماری مهم گندم ‭(L. Triticum aestivum) ‬در ایران است. این بیماری باعث کاهش شدید عملکرد، کیفیت دانه و ایجاد مشکلات سمی در غذای انسان و خوراک دام می شود. اگرچه درگندم وجود تنوع ژنتیک برای مقاومت به ‭FHB ‬وجود دارد ولی اصلاح برای افزایش مقاومت به آن مشکل و وقت گیر است. در حال حاضر کاربرد نشانگرهای دی.ان.ا می تواند در آسان سازی، تسریع و تکمیل روش های بهنژادی برای افزایش مقاومت به بلایت فوزاریومی سنبله در گندم موثر باشند. در این تحقیق بمنظور تهیه داده های فنوتیپی برای مکان یابی ژنهای کنترل کننده مقاومت به ‭FHB‬، جمعیت های F3 و F5 حاصل از تلاقی های والدین مقاوم و نیمه مقاوم ‭Wangshuibai ‬و ‭Frontana ‬با والد حساس ‭Falat ‬در طی دو سال در مزرعه مورد ارزیابی قرار گرفتند. توسعه بیماری بوسیله سطح زیر منحنی پیشرفت آلودگی ‭(AUDPC) ‬اندازه گیری شد. نتایج نشان داد والدین و جمعیت های در حال تفکیک دارای اختلاف های معنی دار در مقاومت به ‭FHB ‬در ‮‭18‬ تا ‮‭22‬ روز پس از آلودگی اولیه بودند. نتایج تجزیه واریانس نشان داد اثر ژنوتیپ معنی دار بود. توزیع فراوانی ‭AUDPC ‬نشان داد که تفکیک متجاوز برای حساسیت و مقاومت در نسل های در حال تفرق حاصل از هر دو تلاقی مشاهده شد که نشان دهنده انتخاب صحیح والدین جهت تشکیل جمعیت های در حال تفرق بود. تجزیه ‭QTL ‬با استفاده از ‮‭421‬ نشانگر ‭AFLP ‬و ‭SSR ‬در جمعیت های در حال تفرق حاصل از تلاقی ‭Falat ‬ا ‭Wangshuibai ‬نشان داد مهمترین ‭QTL ‬های کنترل کننده مقاومت به ‭FHB ‬روی کروموزومهای 3‭BS ‬و 2‭DL ‬قرار دارند‭. QTL ‬های تعیین شده حدود ‮‭30‬ درصد از واریانس آلودگی را با اثر منفی توجیه کردند. تجزیه ‭QTL ‬با استفاده از ‮‭273‬ نشانگر ‭AFLP ‬و ‭SSR ‬در جمعیت های در حال تفرق حاصل از ‭Falat ‬ا ‭Frontana ‬نشان داد که کروموزومهای1‭BL ‬3،‭AL ‬و7‭AS ‬بیشترین اثر منفی و معنی دار را بر واریانس آلودگی داشتند. چون ژنهای کنترل کننده مقاومت به ‭FHB ‬دارای اثر افزایشی است ترکیبی از ‭QTL ‬های کنترل کننده مقاومت در ‭Frontana ‬با ‭QTL ‬های کنترل کننده مقاومت در ‭Wangshuibai ‬ممکن است منجر به ایجاد ژنوتیپ های گندم مقاوم به ‭FHB ‬شود. در مطالعه ای دیگر برای افزایش تعداد نشانگرهای مولکولی با استفاده از نشانگرهای ‭STS ‬ایجاد شده از ‭EST ‬های گندم نزدیک به ‭QTL ‬های ‭Qfhs-ndsu-‬3‭BS ‬از جمعیت یاد شده استفاده شد. از تعداد ‮‭100‬ پرایمر طراحی شده از ‭EST ‬های گندم، یک نشانگر ‭EST ‬برروی کروموزوم های 3‭BS ‬مکان یابی شد. براساس نتایج حاصل یک ‭QTL ‬در حد فاصل دو مکان کروموزومی ‭Xsts‬3‭B-‬‮‭1-138‬‭_Xgwm‬‮‭493‬ برروی کروموزوم 3‭BS ‬برای مقاومت به ‭FHB ‬شناسایی شد که قادر بود ‮‭16‬ درصد از تغییرات فنوتیپی را توجیه کند. آنالیز ‭BLASTn ‬نشان داد که توالی ‮‭138-1‬‭-Xsts‬3‭B ‬دارای شباهت زیادی با ژن مشابه مقاومت ‭(RGA) ‬می باشد. بر اساس آنالیز کمی این ژن با استفاده از ‭Real-Time PCR ‬بیان کمی ‮‭138‬‭-Xsts-‬3‭B ‬در ونگشوبای در زمان ‮‭96‬ ساعت بعد از آلودگی ‮‭2/6‬ برابر بیشتر از فلات بود. نتایج ما تاکید می کند که نشانگر ‮‭138‬‭-Xsts-‬3‭B ‬ایجاد شده از ‭EST ‬قادر است در انتخاب به کمک نشانگر برای افزایش مقاومت به ‭FHB ‬در گندم مورد استفاده قرار گیرد. در مرحله بعد جهت ایجاد نشانگرهای مبتنی بر ‭EST ‬پیوسته با ژن های کنترل کننده مقاومت به ‭FHB ‬در گندم، عملکرد بیولوژیک (عمل ژن های بیان شده) ‮‭8660‬ ‭EST ‬موجود در بانک های اطلاعات بررسی شد. در مجموع ‮‭260‬ ‭EST ‬با عملکرد بیولوژیک مشخص انتخاب شدند. در مجموع ‮‭62‬ جفت آغازگر با استفاده از نقاط حفظ شده و غیر حفظ شده طراحی شد. تجزیه لینکاژ و ‭QTL ‬با استفاده از داده های ژنوتیپی و فنوتیپی در نسل های F3 و F5 حاصل از تلاقی والدین حساس فلات و نیمه مقاوم فرونتانا نشان داد که نشانگر طراحی شده بر اساس ژن ‭NPR‬1 در کاهش میزان آلودگی ‭FHB ‬موثر است و قادر است حداکثر ‮‭9/6‬ درصد از تغییرات واریانس سطح زیر منحنی پیشرفت آلودگی را با اثر منفی توجیه کند. نتایج نشان داد که نشانگر طراحی شده روی بازوی کوتاه کروموزوم A3 قرار دارد. الگوی تظاهر ژن ‭NPR‬1 با استفاده از روش ‭QRT-PCR ‬بررسی شد. نتایج نشان داد ژن ‭NPR‬1 می تواند به عنوان ژن کاندیدای مقاومت به بلایت فوزاریومی سنبله در برنامه به نژادی گندم معرفی شود. کلمات کلیدی: بلایت فوزاریومی سنبله، ‭NPR‬1، ‭Real Time PCR ‬کلمات کلیدی: گندم، ‭QTL‬، ‭SSR‬، ‭AUDPC‬، ‭AFLP