ارزیابی روش الایزا جهت اندازه گیری آفلاتوکسین ‭M1 ‬در شیر به منظور تهیه کیت - فاز اول (تهیه آفلاتوکسین کانژوگه)

چکیده تشخیص آفلاتوکسین ها به روش الایزا که از دقیق ترین روشها برای اندازه گیری این نوع سموم می باشد نیازمند تهیه مشتقات آفلاتوکسین با پروتیین است. در این مطالعه آفلاتوکسینM1 به آلبومین گاوی‭BSA))‬متصل و کونژوگه آن تهیه گردید. سپس آنتی بادی ضد این کونژوگه در خرگوش تهیه شد. برای تهیه کونژوگه آفلاتوکسینM1 با آلبومین گاوی ابتدا آفلاتوکسین M1 در یک شرایط ملایم در مخلوطی از حلالهای پیریدین-متانول- آب در حضور‭O- ‬کربوکسی متیل هیدروکسیل آمین همی هیدروکلراید برای تولید یک محصول واکنش پذیر با پروتیین ها که دارای یک گروه کربوکسیل آزاد می باشد واکنش داده شد. محصول بدست آمده (آفلاتوکسین‭-O-M‬1 کربوکسی متیل اکسیم) بعد از تبخیر کردن حلال، در حضور یک کربودی ایمید ‭(ADC) ‬به ‭BSA ‬وصل شد. اتصال آفلاتوکسینM1 به ‭O ‬کربوکسی متیل هیدروکسیل آمین همی هیدروکلراید با استفاده از کروماتوگرافی لایه نازک ‭(TLC) ‬روی پلیت سلیکاژل و همچنین با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا تجزیه و تحلیل شد. اتصال آفلاتوکسین‭-O-M‬1کربوکسی متیل اکسیم به آلبومین گاوی نیز با اسپکتروفتومتری ‭UV-VHS‬بررسی شد. نتایج حاصل از این روش نشان داد که به هر مولکول ‭BSA ‬تقریبا ‮‭12‬مولکول آفلاتوکسین M1متصل شده است. به منظور تولید آنتی بادی پلی کلونال علیه آفلاتوکسین M1،کونژوگه ‭AFM‬1‭-BSA‬به خرگوش تزریق شد و تیتر آنتی بادی حاصله با استفاده از الایزای غیر مستقیم تعیین شد. نتایج الایزا نشان داد که بعد از تزریق چهارم تیتر آنتی بادی مناسب است. آنتی بادی حاصله با استفاده از رسوب سولفات آمونیوم وکروماتوگرافی تعویض آنیون تخلیص شد. سپس آنتی بادی ضد ‭BSA ‬با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی دارای لیگاند ‭BSA ‬از آنتی بادی علیه آفلاتوکسینM1 تفکیک گردید. در نهایت با استفاده از آنتی بادی حاصله روشی از الایزا برای اندازه گیری آفلاتوکسینM1 مورد بررسی قرارگرفت. واژه های کلیدی:آفلاتوکسین M1،آلبومین گاوی،کونژوگه،الایزا، شیر