تعیین هویت سویه های استاندارد مایکوباکتریوم اویوم تحت گونه پاراتوبرکولوزیس مورد استفاده در تولید ‭PPD ‬پاراتوبرکولین (یونین) ساخت موسسه رازی به روش ‭Nested PCR‬

مایکوباکتریوم اویوم تحت گونه پاراتوبرکولوزیس‭Mycobacterium avium subsp paratuberculosis (MAP) ‬درنشخوارکنندگان بیماری پاراتوبرکولوزیس (یون) راایجاد می کند در کمپلکس مایکوباکتریوم اویوم ‭(MAC) complex Mycobacterium avium ‬هشت گونه وجود دارد که در گونه مایکوباکتریوم اویوم باکتریهای مایکوباکتریوم اویوم تحت گونه پاراتوبرکولوزیس‭MAP ‬مایکوباکتریوم اویوم تحت گونه ایویوم ‭(MAA) avium Mycobacterium avium subsp ‬مایکوباکتریوم اویوم تحت گونه سیلواتیکوم‭Mycobacterium avium subsp silvaticum(MAS) ‬مایکوباکتریوم اویوم تحت گونه هومینیس‭Mycobacterium avium subsp hominissuis(MAH) ‬به عنوان کلون وتحت گونه تعریف ومعرفی شده اند. علیرغم شباهت ژنتیکی بسیار میان ‭MAP‬و مایکوباکتریوم اویوم تحت گونه ایویوم ( ،‭(MAA‬امروزه مارکر ‭IS‬‮‭900‬ بطول ‭bp‬‮‭1451‬ بعنوان یک مارکر اختصاصی ‭MAP ‬شناخته شده است که به تعداد‮‭10-20‬ تکراردر ژنوم این باکتری وجود دارد. یونین که آنتی ژن مورد استفاده در تست جلدی تشخیصی پاراتوبرکولوزیس می باشد از کشت انبوه سه سویه مایکوباکتریوم اویوم تحت گونه پاراتوبرکولوزیس‭((MAP ‬به نامهای ‭III&V‬، 2‭e ‬، ‮‭316‬Fتهیه می شود. در این تحقیق با هدف دستیابی به توان تشخیص افتراق مولکولی میان سویه های استاندارد مولد یونین وتوبرکولین سه سویه تولیدی ‭MAP ‬به نامهای ‭III&V‬، 2‭e ‬و ‮‭316‬Fمورد استفاده در تولید یونین روی محیط کشت اختصاصی ‭Herrold's egg-yolk ‬ویک سویه مولد توبرکولین مرغی بنام D4‭- MAA ‬و یک سویه مولد توبرکولین گاوی بنام ‭AN‬5 و یک سویه مایکوباکتریوم توبرکولوزیس‭M.tb-DT ‬روی محیط ‭Lowenstein Jensen‬تجدید کشت و بمدت ‮‭6-8‬ هفته تا زمان دستیابی به رشد مناسب میکروبی در ‮‭37‬ ‭C ‬نگهداری گردیدند. در مرحله بعد ‭DNA ‬باکتریایی هر شش سویه به روش متعارف ‭Van Soolingen ‬استخراج و از آنها در انجام یک الگوریتم تشخیصی متشکل از آزمون های ‮‭16‬‭SrRNA- PCR (‬شناساگر جنس مایکوباکتریوم)، ‭IS‬‮‭6110‬‭- PCR (‬شناساگر کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکولوزیس) ،‭IS‬‮‭1245‬‭- PCR(‬شناساگر کمپلکس مایکوباکتریوم ایویوم)، ‮‭900‬‭-PCR (‬شناساگر اختصاصی ‭MAP) ‬وبالاخره ‮‭901‬‭-PCR (‬شناساگر اختصاصی ‭(MAA ‬استفاده گردید. در نتیجه انجام این استراتژی در مرحله نخست با تولید یک قطعه بطول ‮‭543‬ ‭bp ‬توسط هرشش سویه هویت آنها بعنوان اعضای جنس مایکوباکتریوم احراز گردید. در آزمون ‭IS‬‮‭6110‬‭- PCR ‬با تولید یک محصول ‭PCR ‬بطول ‮‭245‬ ‭bp ‬موجودیت این مارکر فقط در ژنوم سویه های مایکوباکتریوم بویس‭AN‬5 و مایکوباکتریوم توبرکولوزیس ‭DT‬نشان داده شد که موید هویت آنها بعنوان اعضای کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکولوزیس می باشد. در آزمون ‭IS‬‮‭1245‬‭- PCR‬فقط سویه D4‭- MAA ‬واجد این سکانس الحاقی (‮‭427‬ ‭bp) ‬نشان داده شد. درآزمون ‮‭901‬‭-PCR ‬تولید یک قطعه بطول ‭bp‬‮‭1108‬ فقط در مورد سویه D4‭-MAA ‬مشاهده گردید که بدین ترتیب هویت آن بعنوان مایکوباکتریوم اویوم تحت گونه اویوم مورد تایید قرار گرفت. در نهایت با انجام آزمون‭Nested PCR-IS‬‮‭900‬ فقط درسه سویه مایکوباکتریوم اویوم تحت گونه پاراتوبرکولوزیس‭((MAP ‬به نامهای ‭III&V‬، 2‭e ‬، ‮‭316‬‭F ‬موجودیت این سکانس الحاقی (بطول ‮‭300‬ ‭bp) ‬احراز گردید. بدین ترتیب با انجام این تحقیق ضمن دستیابی به یک استراتژی تشخیص افتراقی در تفکیک سویه های استاندارد مولد توبرکولین ویونین، شناسنامه مولکولی این سویه ها که در موسسه رازی استقرار دارند تعیین گردید و امکان تشخیص سریع وقوع موارد احتمالی آلودگی های متقاطع میان این سویه ها در جریان عملیات آزمایشگاهی فراهم گردید. 2- واژه کلیدی و علایم اختصاری ‭IS‬‮‭900‬- ، ‭IS‬‮‭16 6110‬ ‭S rRNA ‬، ، ‭IS‬‮‭1245‬‭- Nested PCR ‬، ‭IS‬‮‭901‬ یونین ، ‭PPD