خالص سازی توکسین اپسیلون از کلستریدیوم پرفرنژنس تیپ ‭D ‬سویه واکسنی

با توجه به ضرورت تهیه یک کشت فعال و توانمند برای تولید توکسین ، پس از رشد اولیه باکتری میزان توکسین اپسیلون تولید شده و حضور آن در محیط کشت با استفاده از کشت ‭Vero ‬تایید گردید. نتایج ‭MLD ‬نمونه کشت فوق نیز باعث مرگ 3 موش در رقت ‮‭1/500‬ گردید. این نتایج گواه بر حضور فعالیت توکسین اپسیلون در محیط کشت می دهد. به منظور تایید مولکولی باکتری از ‭DNA ‬ژنومی استخراج شده با پرایمر های تشخیصی ژن توکسین اپسیلون باکتری، ‭PCR ‬صورت گرفت و باند مشاهده شده به اندازه ‮‭1098‬ باز بر اساس مارکر درژل آگارز باکتری و توکسین اپسیلون تولید شده را تایید نمود. محیط کشت حاوی توکسین پس از تایید حضور و فعالیت آن با درصد های مختلف آمونیوم سولفات رسوب دهی داده شده است. نتایج این رسوب دهی با آمونیوم سولفات نشان داد که بهترین درصد آمونیوم سولفات برای استخراج بیشترین مقدار توکسین با درصد کمتری از پروتیین های ترشحی بین ‮‭50-35‬ درصد می باشد. پس از رسوب دهی اولیه توکسین، نمونه دیالیز گردید که بخشی از پروتیین های کوچک و همچنین نمک های آمونیوم سولفات از محیط خارج گردید. در مرحله تعویض یونی ‮‭5/7‬ ‭pH ‬از نظر عدم اتصال توکسین و همچنین از نظر خلوص بدست آماده دارای کیفیت مناسب تری بود. نتایج ‭SDS-PAGE ‬بدست آماده از این مرحله نشان داد که توکسین با خلوص بالا در مرحله اولیه اختلاط در ستون تعویض یونی بدون اتصال به ستون از آن خارج شده و پروتیین های دیگر به ستون متصل و باعث تولید یک توکسین خالص می گردد. با توجه به نتایج ‭SDS-PAGE ‬و خلوص بالای توکسین مقدار توکسین خالص در نمونه مورد بررسی با استفاده از روش برادفورد تعیین و با استفاده از ‭SDS-PAGE ‬مورد تایید قرار گرفت. جهت تعیین خلوص و میزان توکسین استخراج شده آنتی سرم خرگوشی از توکسین تهیه گردید و جهت انجام تست وسترن بلات و الیزا مورد استفاده قرار گرفت. نتایج وسترن بلات از نمونه های خالص شده نشان داد که علاوه بر خلوص مناسب توکسین، آنتی بادی تهیه شده دارای اختصاصیت مناسبی می باشد. نتایج الیزا نمونه های خالص و اولیه با استفاده از آنتی بادی تهیه شده نشان داد که توکسین در مراحل مختلف خالص شده و فعالیت ویژه ( بر اساس واکنش آنتی بادی- آنتی ژن) افزایش یافته است. وزن ملکولی توکسین بر اساس روش ‭SDS-PAGE ‬مورد ارزیابی قرار گرفت. در این روش بر اساس نتایج بدست آماده توکسین همراه با پیش ساز‭( protoxin ) ‬نزدیک به ‮‭34400‬ دالتون و وزن ملکولی توکسین فعال شده ‭(activated toxin) ‬نزدیک به ‮‭32600‬ دالتون می باشد. بر اساس محاسبات صورت گرفته وزن بخش جدا شده از توکسین اولیه نزدیک ‮‭1800‬ دالتون می باشد. در بررسی صورت گرفته توکسین بر روی سلولهای ‭Vero‬، ‭MCF-‬7، ‭BHK‬‮‭21‬ اثر داده شد و مشخص شد که با توجه به نوع اثر گذاری و فعالیت توکسین با ایجاد منفذ در سلول، باعث مرگ سلول می گردد. توکسین فعال تزریق شده به موش نشان داد که مراحل استخراج پروتوکسین تغییری در توکسین زایی ایجاد ننموده و پروتوکسین پس از فعال سازی قادر به ایجاد بیماری نیز می باشد . با توجه به تعارف انجام شده این توکسین قادر است در غلظت 5 نانوگرم در میلی لیتر دارای خاصیت کشندگی باشد و غلظت های پایین تر این توان را کاهش می دهد. لذا‭LD‬‮‭50‬ توکسین فعال اپسیلون معادل ‮‭110‬ نانوگرم در کیلوگرم بیان شد. نتایج گرفته شده از این تحقیق نشان داد که نحوه خالص سازی مناسب بوده و پایداری توکسین درمسیر خالص سازی حفظ شده است. لذا جهت بکارگیری بیشتر توکسین پیشنهاد می شود: از توکسین بدست آمده جهت تهیه آنتی بادی بر علیه توکسین در دو حیوان ( خرگوشی و بزی) استفاده شود، همچنین از دو محصول فوق جهت تهیه کیت تشخیصی آنتی بادی و آنتی ژن از توکسین خالص استفاده شود. این توکسین می تواند در موارد مختلف بکار گرفته شود.1-ارزیابی واکسن ها و تعیین توانمندی واکسن( پوتنسی)، 2-کنترل تولید توکسین در حین فرمانتاسیون توسط باکتری، 3-ارزیابی وکنترل بیماری در فیلد4،-ارزیابی ایمنی در حیوان در زمان غربالگری اثر واکسن تولیدی.5- پدافند غیر عامل جهت کنترل آلودگی.6- مطالعات مختلف بر روی روند مرگ سلولی . با توجه به عدم دسترسی به توکسین خالص در گذشته با رفع این موانع داشتن دانش فنی تولید توکسین خالص ، دسترسی آسان و تهیه کیت های مورد نیاز می تواند کشور و بخش تولید واکسن را از این کمبود بهرمند نماید. کلمات کلیدی: توکسین اپسیلون، کلستریدیوم پرفرنژنس، پروتوکسین، توکسین فعال