کلونینگ و بیان ژن توکسین آلفا کلستریدیوم سپتیکوم در ‭E. coli.‬

کلستریدیوم سپتیکوم یک باکتری میله ای، گرم مثبت، بی هوازی، بدون تحرک و اسپورزا می باشد که به علت تنوع چشمگیر اندازه ژنومش در طبیعت حضور دارد و بر اساس تولید 4 توکسین کشنده مهم آلفا، آلفا، اپسیلون و یوتا به 5 زیر گونه ‭A ‬تا ‭E ‬تقسیم می شود. توکسین آلفا سایتولایتیک است و تمام سلول ها از جمله انسان، لنفوسیت، گلبولهای قرمز و پلاکت را تحت شعاع قرار میدهند. آسیب غشا سلولی توسط توکسین آلفا طی سه مرحله صورت می پذیرد. توالی رمز کننده توکسین آلفا از ‭GenBank ‬تهیه و با استفاده از نرم افزار ‭Oligo ‬پرایمرهای مناسب طراحی شدند. باکتری کلستریدیوم سپتیکوم فریزدرای در لوله آزمایش حاوی محیط جگر انتقال داده شد و به مدت ‮‭24‬ ساعت در جار بی هوازی‮‭37‬ ‭c ‬انکوبه گردید‭. DNA ‬ژنومیک با روش های مبتنی بر استفاده از فنل کلروفرم استخراج شد. سپس با استفاده از ‭PCR ‬و آنزیم های دارای خاصیت اصلاح ‭(Pfu) ‬ژن آلفا تکثیر و در وکتور ‭pJET ‬لایگیت گردید. محصول لایگیشن با باکتری ‭E. coli/TOP‬‮‭10‬ ترانسفورم شد و کلون های نوترکیب روی محیط حاوی آنتی بیوتیک آمپی سیلین انتخاب شدند. در مرحله بعد پلاسمید حاوی ژن نوترکیب از باکتری میزبان استخراج شد و توالی یابی گردید. توالی تایید شده با شمار ‭JN‬‮‭793989‬ در بانک ژن ثبت گردید. پس از استخراج پلاسمید از ‭E. coli/TOP‬‮‭10‬‭/pJET sep‬، پلاسمید نوترکیب با استفاده از روش های مختلفی از جمله ‭Colony PCR‬، آنالیز هضم آنزیمی و تعین توالی ارزیابی و تایید شد. پس از برش آنزیمی، ژن توکسین آلفا از پلاسمید استخراج و در وکتور بیانی ‭(+)pET‬‮‭22‬‭b ‬لایگیت و ساب کلون شد سپس وکتور نوترکیب ‭pET‬‮‭22‬‭b sep ‬در میزبان ‭E. coli/rosetta ‬بیان شد، بیان پروتیین با استفاده از‭SDS-PAGE ‬و وسترن بلاتینگ مورد ارزیابی قرارگرفت .نتایج نشان دادند که ژن توکسین آلفا کلستریدیوم سپتیکوم در کلون نوترکیب ‭E. coli/rosetta/pET‬‮‭22‬ بخوبی بیان شده است و میتوان از آن به عنوان پروتیین نوترکیب استفاده کرد و با تولید انبوه آن روش های پیشگیری از بیماری های ناشی از کلستریدیوم سپتیکوم را با تولید واکسن نوترکیب بهینه سازی نمود.با توجه به اینکه تا کنون روی کلونینگ و بیان ژن توکسین آلفا کلستریدیوم سپتیکوم در باکتری ‭E. coli ‬در ایران تحقیقی مشاهده نشده بود این پژوهش می تواند منجر به تولید واکسن نوترکیب شود. واژه های کلیدی: کلستریدیوم پرفرینجنز، آلفاتوکسین، انتروتوکسمی، کلونینگ، بیان