کلونینگ و بیان ژن توکسین آلفا کلستریدیوم ادماسین (نووآی تیپ ‭B) ‬در ‭E. coli.‬

کلستریدیوم ادماسین بر حسب توکسین های مترشحه (آلفا ، بتا ، گاما ، دلتا و اپسیلون) و بیماری هایی که تولید می کند به چهار تیپA،B،C،‭D ‬طبقه بندی می گردد. هر تیپ این باکتری بیماری های خطرناکی در انسان و مخصوصا در دام ایجاد می کند که از نظر اقتصادی قابل ملاحظه می باشند. توکسین آلفا، توکسین اصلی دو تیپ A،‭B ‬بوده که خاصیت کشندگی و نکروز دهندگی دارد. توالی رمز کننده توکسین آلفا از ‭GenBank ‬تهیه و با استفاده از نرم افزار ‭Oligo ‬پرایمرهای مناسب طراحی شدند. باکتری کلستریدیوم نووآی تیپ ‭B ‬فریزدرای در لوله آزمایش حاوی محیط جگر انتقال داده شد و به مدت ‮‭24‬ ساعت در جار بی هوازی ‮‭37‬ ‭ c ‬انکوبه گردید‭. DNA ‬ژنومیک با روش های مبتنی بر استفاده از فنل کلروفرم استخراج شد. سپس ژن آلفا با استفاده از ‭PCR ‬و آنزیم ‭Taq DNA polymerase‬تکثیر و در وکتور ‭pJET ‬لایگیت گردید. محصول لایگیشن با باکتری ‭E. coli/TOP‬‮‭10‬ ترانسفورم شد و کلون های نوترکیب روی محیط حاوی آنتی بیوتیک آمپی سیلین انتخاب شدند. در مرحله بعد پلاسمید حاوی ژن نوترکیب از باکتری میزبان استخراج شد و توالی یابی گردید. پس از استخراج پلاسمید از ‭E. coli/TOP‬‮‭10‬‭/pJET ‬، پلاسمید نوترکیب با استفاده از روش های مختلفی از جمله ‭Colony PCR‬، آنالیز هضم آنزیمی و تعین توالی ارزیابی و تایید شد. با توجه به اینکه تا کنون روی کلونینگ ژن توکسین آلفا کلستریدیوم نووآی تیپ ‭B ‬در باکتری ‭E. coli ‬در ایران تحقیقی مشاهده نشده بود این پژوهش می تواند منجر به تولید واکسن نوترکیب شود. واژه های کلیدی: کلستریدیوم نووآی، توکسین الفا، گازگانگرن، قانقاریای عفونی کبد، کلونینگ