بهینه سازی منحنی استاندارد تکثیر cDNA ژن EpCAM توسط روش Real Time PCR

سرطان پستان شایع ترین بدخیمی در میان زنان است. وضعیت بیان پروتوآنکوژن EpCAM یکی از مارکرهای مولکولی مهم در تعیین نوع درمان می باشد EpCAM گیلکوپروتیین غشایی است که در میانکنشهای متصل کننده هموفیلیک درگیر می باشد. بیان افزایش یافته EpCAM در 30%-40 40 از سرطان های پستان دیده می شود. در این تحقیق از 50 بیمار مشکوک به سرطان پستان در استان اصفهان نمونه گیری به عمل آمد. بافت حاصل به سرعت در نیتروژن مایع منجمد شد. بعد از انتقال این نمونه ها به مرکز پژوهشی، تا زمان استخراج RNA در 70- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. استخراج RNA از نمونه های منجمد و تازه از طریق Qiagen) RNeasy mini kit) صورت پذیرفت به طوری که RNA حاصل به سرعت در دمای 70 - درجه سانتیگراد قرار گرفت. جهت تهیه رشته اول از cDNA کل از کیت (Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas استفاده گردید. در گام نهایی توسط PCR و پرایمرهای اختصاصی مربوط به cDNA ژن EpCAM، تکثیر این ژ ن مورد ارزیابی قرار گرفت. علاوه بر پرایمر های EpCAM از پرایمرهای GAPDH هم به عنوان ژن کنترل استفاده شد. پس از اجرای شرایط به دست آمده از بهینه سازی شرایط PCR در مرحله Real Time PCR، حالتایده آلی مشاهده نشد که علت آن تفاوت در نوع بافر به کار رفته و احتمالا تفاوت در نوع دستگاه به کار رفته جهتتکثیر cDNA است. منحنی ذوب مربوط به تکثیر cDNA از طریق Real Time PCR قبل و بعد از بهینه سازی شرایط در شکل آمده است. تغییر در پروتوکل و دما و غلظت +Mg2، تاثیر مثبتی در پهنه سازی فرآیند تکثیر نداشت اما استفاده از گرادیانت پرایمری مشخص کرد که بهترین شرایط مربوط به غلظ 0/4 می باشد.