مقایسه دو روش PCR اختصاصی با روش DNA sequencing جهت تعیین هویت انگل های لیشمانیای عامل سالک در بیرجند

سابقه و هدف: عوامل اصلی ایجاد لیشمانیوز جلدی (سالک) در ایران شامل لیشمانیا تروپیکا و لیشمانیا ماژور می باشند. جهت تعیین هویت انگل عامل بیماری از روشهای مختلف بیوشیمیایی و مولکولی استفاده می شود. از رایج ترین روشهای مولکولی، یکی تکثیر قطعه متغیر از DNA کینتوپلاستی لیشمانیا (KDNA) توسط PCR و دیگری PCR-RFLP قطعه ITS1 از DNA ریبوزومی این انگل است. در این تحقیق صحت این دو روش جهت تعیین گونه عوامل ایجاد کننده سالک در بیرجند در مقایسه با نتایج DNA sequencing نمونه ها مورد آزمایش قرار گرفته است. مواد و روش ها: در این مطالعه مقطعی، نمونه های اسلاید میکروسکوپی بیماران مبتلاء به سالک طی سالهای 1387 تا 1391 که در مرکز بهداشت شهرستان بیرجند موجود بود، مورد برررسی قرار گرفتند. ابتدا گسترش سطح اسلایدها تراشیده شده و استخراج DNA از آنها انجام شد. سپس در روش اول، بخش متغیر از DNA کینتوپلاستی انگل لیشمانیا تکثیر یافته و پس از الکتروفورزیس بر روی ژل آگاروز، با توجه به اندازه باند حاصل گونه انگل تشخیص داده شد. در روش دوم، قطعه ITS1 از DNA ریبوزومی انگل با استفاده از پرایمرهای اختصاصی تکثیر یافته و سپس با تکنیک PCR-RFLP الگوی برش آنزیمی توسط آنزیم محدود کننده بررسی و گونه انگلها مشخص شد. در نهایت توالی قطعه ITS1 در تعدادی از نمونه ها با استفاده تکنیک DNA sequencing تعیین گردیده و با نتایج حاصل از دورروش PCR ذکر شده مقایسه گردیدند. یافته ها: مجموعا 84 اسلاید بررسی گردیدند که از این تعداد، KDNA PCR تنها قادر به تکثیر و تعیین گونه 46 نمونه بوده اما روش PCR-RFLP توانست تمامی نمونه ها را تعیین گونه نماید. از این 46 نمونه مشترک، با روش KDNA PCR 41 نمونه لیشمانیا تروپیکا و 5 نمونه لیشمانیا ماژور تشخیص داده شد. در حالیکه کاربرد روش PCR-RFLP، 45 نمونه را لیشمانیا تروپیکا و تنها 1 نمونه را لیشمانیا ماژور نشان داد. در عین حال، نتایج DNA sequencing صحت تعیین گونه توسط روش PCR-RFLP را تایید نمود.نتیجه گیری: با توجه به آنکه تکنیک DNA sequencing بعنوان روش قطعی تعیین هویت انواع موجودات زنده ازجمله انگل های جنس لیشمانیا به شمار می رود، بنظر می رسد روش PCR-RFLP قطعه ITS1 در قیاس با روش دیگر علاوه بر حساسیت بالاتر از صحت بیشتری هم برخوردار بوده و نتایج تعیین هویت انگل توسط آن قابل اعتمادترند.

کلیدواژه ها:

PCR-RFLP ، لیشمانیوز جلدی ، DNA sequencing ، تعیین گونه