کلونینگ و طراحی مستقیم تعیین جهت کلونینگ ژن فاکتورIXدر وکتور گیاهی

بیماری هموفیلیBیکی از شایع ترین بیماریهای انعقادی ژنتیکی بوده که در نتیجه حذف و یا کاهش سطح فاکتورIXفعال در خون ایجادمی شود. درمان معمول این بیماری به روش جایگزین درمانی انجام میگیرد که شامل تزریق فاکتورIX مشتق شده از پلاسمای افراد نرمال و یا استفاده از فاکتورIX نوترکیب می باشد. یکی از روش های تولید شکل نوترکیب فاکتورIX استفاده از یک بیوراکتور کارآمد جهتاستفاده از یک بیوراکتور کارآمد جهت استفاده از یک بیوراکتور کارآمد جهتتولید محصول ژن است که امروزه از گیاهان به عنوان بیوراکتور و کارخانههای زیستی بطور گسترده ای استفاده میشود. لذا با هدف جداسازی ژن فاکتور انعقادیIX انسانی بدون جهش و کلونینگ صحیح آن در وکتور بیانی گیاهی، تکثیر ژن فاکتور انعقادیIX انسانی با استفاده از پرایمرهایhFIX-R و hFIX-F-BamHIاز کتابخانهcDNAکبدی صورت گرفت. محصول تکثیر شده باPfuپلیمراز، پس ازخالص سازی از ژل و آدنیله شدن در پلاسمیدpTZR/Tکلون گردید. پلاسمیدهای نوترکیب از باکتری هایE.coli DH5ترانسفورم شده استخراج و ژن فاکتورIX با استفاده از پرایمرهای درون وکتوریM13F-pUC و M13R-pUCدر دو جهت تعیین توالی گردیدند مقایسه این توالی با توالی ثبت شده این ژن در بانک ژنیNCBIنشان داد که قطعه کلون شده مربوط به ژن سنتز کننده فاکتور انعقادیIX انسانی و فاقد جهش می باشد. سپس قطعه مورد نظر آماده جایگزینی مستقیم و در جهت صحیح با ژنGusAدر وکتور بیانی گیاهی pBI121با دو آنزیمSacI و BamHIگردید. از این سازه می توان جهت بیان این ژن در سوسپانسیون سلول گیاهی و انتقال ژن مذکور به گیاه استفاده نمود

کلیدواژه ها:

هموفیلیB ، فاکتور انعقادیIX ، بیوراکتور ، گیاه تراریخت