طراحی و راه اندازی روش Multiplex PCR به منظور شناسایی لیشمانیا تروپیکا و لیشمانیا ماژور

مقدمه: لیشمانیوز جلدی یکی از معضلات مهم بهداشتی در ایران است که عمدتا توسط دو گونه لیشمانیا ماژور (نوع روستایی/مرطوب) و لیشمانیا تروپیکا (نوع شهری/خشک) ایجاد می شود. تشخیص دقیق و سریع این دو گونه برای انتخاب درمان مناسب و کنترل بیماری ضروری است. روش های میکروسکوپی سنتی حساسیت پایینی داشته و قادر به تفکیک گونه ها با موفولوژی یکسان نیستند. در حالی که روش های مولکولی ابزاری حساس تر و اختصاصی تر محسوب می شوند. این مطالعه با هدف طراحی و بهینه سازی روش Multiplex PCR برای شناسایی همزمان مولکولی لیشمانیا ماژور و لیشمانیا تروپیکا با استفاده از اهداف ژنی اختصاصی شامل ITS۲، COII و AAP۳ از دو گونه ی مذکور انجام شد. مواد و روش ها: DNA ژنومی از سویه های استاندارد  این دو گونه با استفاده از روش فنل‑کلروفرم استخراج و کیفیت آن با نانودراپ و الکتروفورز تایید شد. پرایمرهای اختصاصی برای ژن های مذکور بر اساس توالی های موجود در بانک ژن NCBI طراحی و با BLAST بررسی شدند. ژن GAPDH (۱۱۰جفت باز) به عنوان کنترل داخلی در نظر گرفته شد.قطعات هدف ابتدا به صورت مجزا با PCR تکثیر و سپس در وکتور pTZ۵۷R/T  کلون شدند. پلاسمیدهای نوترکیب در باکتری Top۱۰ ترانسفورم شده و پس از تایید با کلونی‑PCR، استخراج و به عنوان کنترل مثبت استفاده شدند. در ادامه، واکنش های دوبلکس PCR (مالتیپلکس) برای هر گونه به صورت جداگانه بهینه سازی و حساسیت آزمون با تهیه رقت های سریالی از پلاسمیدها و محاسبه حد تشخیص)  (LOD بر اساس تعداد کپی، تعیین شد. یافته ها: قطعات ژنیAAP۳ (۴۶۸ جفت باز) و COII (۲۱۳ جفت باز) برای لیشمانیا ماژور ITS۲ (۲۰۰ جفت باز) و  COII(۴۲جفت باز) برای لیشمانیا تروپیکا از DNA ژنومی استخراج شده از سویه های استاندارد با موفقیت تکثیر شدند. اندازه باندها با محاسبات نرم افزاری مطابقت داشت حد تشخیص برای لیشمانیا ماژور به ترتیب ۱۹ کپی برای ژن AAP۳ ،۴۱ کپی برای ژنCOII  و برای لیشمانیا تروپیکا به ترتیب ۲۸۵ کپی برای ژن ITS۲ و۴۴ کپی برای ژن COII محاسبه شد. واکنش های مالتیپلکس بهینه سازی شده، باندهای متمایز مربوط به هر دو ژن هدف را به همراه کنترل داخلی با وضوح مناسب نشان دادند. نتیجه گیری: روش مالتیپلکس PCR طراحی شده با به کارگیری همزمان اهداف ژنی هسته ای ITS۲ ، میتوکندریایی COII وعملکردیAAP۳ ، روشی حساس، اختصاصی و سریع برای تشخیص افتراقی لیشمانیا ماژور و لیشمانیا تروپیکا فراهم می آورد. پلاسمیدهای نوترکیب تولیدشده در این مطالعه، کنترل های مثبت ایمن و پایداری را جایگزین کشت زنده انگل می نمایند. این رویکرد گامی عملی به سوی تولید کیت های تشخیص مولکولی بومی برای لیشمانیوز جلدی در مناطق اندمیک ایران محسوب می شود.

کلیدواژه ها:

Leishmania major ، Leishmania tropica ، Multiplex PCR ، Molecular diagnosis ، Cutaneous leishmaniasis ، لیشمانیا ماژور ، لیشمانیا تروپیکا ، مالتی پلکس PCR ، تشخیص مولکولی ، لیشمانیوز جلدی