مقدمه:
انتروویروس های انسانی )EVs(عامل اصلی مننژیت آسپتیک، آنسفالیت، بیماری های شبه سپسیس نوزادی و بیماری دست، پا و دهان هستند که بیش از ۱۰۰ سروتیپ آن ها در ۱۵ گونه طبقه بندی شده اند. تشخیص سریع و حساس برای مدیریت بالینی و کنترل شیوع حیاتی است، اما وابستگی به کیت های تشخیصی وارداتی در محیط های محدود از نظر منابع مانند ایران، چالش برانگیز باقی مانده است. هدف این مطالعه، طراحی، بهینه سازی و اعتبارسنجی اولیه یک آزمون universal یک مرحله ای
RT-PCR با هدف گیری ناحیه بسیار حفاظت شده ۵′-untranslated (۵′-UTR) ژنوم EV برای تشخیص طیف وسیع تمامی گونه های
انتروویروس انسانی بود.
مواد و روش ها: تعداد ۱۲۰ توالی ژنومی کامل EV (شامل
انتروویروس A–D و راینوویروس های نماینده) از بانک ژن GenBank بازیابی شد. هم ترازی چندتوالی با استفاده از نرم افزار MEGA X برای شناسایی نواحی حفاظت شده انجام شد. پرایمرهای universal با استفاده از نرم افزار Oligo۷ طراحی و به صورت in silico از طریق Primer-BLAST در برابر پایگاه داده نوکلئوتیدی NCBI اعتبارسنجی شدند. پرایمرها توسط شرکت پیشگام (تهران، ایران) سنتز شدند. آزمون با استفاده از کیت تجاری one-step
RT-PCR (بیورابیت، ایران) بهینه سازی و با استفاده از واکسن خوراکی پولیو (سویه سابین) به عنوان کنترل مثبت اعتبارسنجی شد. اختصاصیت توسط الکتروفورز ژل آگاروز و غربالگری تقاطعی in silico ارزیابی شد.
یافته ها: جفت پرایمر طراحی شده قطعه ای ۱۱۰ جفت بازی را در ناحیه
۵′-UTR تکثیر کرد. تحلیل in silico پوشش ۱۰۰ درصدی برای تمام انواع اصلی EV را بدون واکنش متقاطع با DNA ژنومی انسان یا پاتوژن های نامرتبط تایید کرد. اعتبارسنجی آزمایشگاهی با استفاده از RNA پولیوویروس، یک باند واضح و مجزا با اندازه مورد انتظار را روی ژل آگاروز ۲ درصد نشان داد، در حالی که کنترل های منفی فاقد باند بودند.
نتیجه گیری: ما یک آزمون
RT-PCR universal قوی، مقرون به صرفه و بومی را گزارش می کنیم که قادر به تشخیص
انتروویروس های انسانی متنوع است. این پلتفرم زیرساختی برای یک
کیت تشخیصی تولید داخلی و قابل دسترس مناسب برای کاربردهای بالینی و سلامت عمومی در ایران و محیط های مشابه فراهم می کند.
