تعیین مناسب‎ ترین زمان برای تعیین جنسیت جنین مرغ بومی ایران با استفاده از طیف سنجی میکرو-رامان

چکیده مبسوط مقدمه و هدف: در حال حاضر، تعیین جنسیت طیور بر اساس تفاوت ‎های ظاهری نر و ماده توسط تکنسین‎های ماهر انجام می ‎شود. این موضوع نیازمند نیروی ماهر است که سبب اتلاف ‎وقت نیز می شود. طیف سنجی رامان یک تکنیک تحلیلی است که بر اساس پراکندگی نور و اثرات ارتعاشی مولکول ها عمل می کند و به ‎عنوان ابزاری غیر مخرب برای تحلیل ساختار شیمیایی و شناسایی مواد مختلف شناخته شده‎ است. این روش برای اولین ‎بار توسط فیزیکدان هندی، چاندرا سخار ونکتا رامان، در سال ۱۹۳۰ کشف شد و به ‎خاطر این دستاورد جایزه نوبل را دریافت کرد. در این روش، نمونه ها با استفاده از لیزر تحریک می شوند و نور پراکنده ‎شده از آن‎ ها اطلاعاتی را در باره ساختار و ویژگی های بیوشیمیایی آن‎ ها ارائه می دهد. یکی از کاربردهای مهم طیف سنجی رامان، تعیین جنسیت جنین جوجه ها در تخم‎ مرغ است. با توجه به تفاوت های بیوشیمیایی میان سلول های پرندگان نر و ماده، این تکنیک می تواند به شناسایی جنسیت تخم ‎مرغ ها بر اساس تجزیه و تحلیل سلول های خون کمک کند. این موضوع به ‎‎ویژه در صنعت طیور اهمیت دارد، زیرا جوجه های با جنسیت ناخواسته معمولا پس از جوجه ریزی کشته می شوند و استفاده از طیف سنجی رامان می تواند به کاهش این ضایعات اقتصادی و اخلاقی کمک کند. ترکیبات خون جنین جوجه با گذشت زمان، از تولید اولیه گلبول های قرمز تا توسعه کامل سیستم خونی تغییرات قابل ‎توجهی را تجربه می کند. لذا، این مطالعه برای تعیین مناسب‎ ترین زمان برای تعیین جنسیت جنین مرغ بومی ایران از طریق آنالیز خون با استفاده از طیف سنجی میکرو رامان UniRAM اجرا شد. مواد و روش ها: تخم مرغ های بارور به ‎منظور طی‎ کردن مراحل جنینی به دستگاه جوجه ‎کشی در دمای ۳۷/۸ درجه سانتی‎ گراد و رطوبت ۵۳ درصد درون دستگاه جوجه ‎کشی قرار داده شدند. جنین‎ ها در سنین ۵۳/۳، ۵، ۸ و ۱۳ روزگی به ‎طور جداگانه با استفاده از دستگاه طیف سنجی میکرو-رامان  UniRAMبا طول موج ۷۸۵ نانومتر تحت ارزیابی قرار گرفتند. به ‎منظور نمایش رگ های جنینی، یک سیستم دوربین توسعه ‎یافته است که به طور خودکار رگ مناسب را شناسایی‎ و تمرکز پرتو لیزر را روی آن متمرکز می کند. طیف های به ‎دست‎ آمده از طیف ‎سنج رامان با استفاده از نرم افزار Origin رسم‎ شدند و مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. از جمله شاخص‎ های اصلی مورد استفاده برای تجزیه و تحلیل طیف رامان، شدت پیک‎ های رامانی و نسبت شدت پیک‎ های غالب بودند. پس از اتمام مراحل آنالیز، به ‎منظور تایید جنسیت جنین‎ ها، آن‎ ها از تخم‎ مرغ خارج شدند و فرآیند استخراجDNA  با استفاده از کیت استخراج Animal Tissue DNA Isolation ساخت شرکت دنازیست انجام شد. سپس کمیت و کیفیت DNA استخراج‎ شده با استفاده از دستگاه نانودراپ (مدل Thermo Scientific NanoDROP. ۲۰۰۰C، کشور آمریکا) و الکتروفورز ژل مورد بررسی قرار گرفتند. ژن اتصال DNA، کروموبوکس هلیکاز ۱ (CHD) به ‎‎عنوان ژن تعیین جنسیت استفاده شد و آغازگرهای اختصاصی برای آن طراحی شدند. به ‎منظور تعیین جنسیت نمونه ‎ها با استفاده از آغازگرهای طراحی شده، ابتدا واکنش زنجیره‎ای پلیمراز (PCR) انجام گرفت و در نهایت نتیجه آزمایش روی ژل آگارز دو و نیم درصد مشاهده شد. یافته ‎ها: طبق نتایج این مطالعه، تفاوت های معنی داری در میانگین شدت فلورسانس بین جنس های نر و ماده تخم ‎مرغ ها مشاهده شدند، هر چند که همپوشانی زیادی وجود داشت. یکی از نمودارهای مورد بررسی در این پژوهش نمودار شمعی بود؛ این نمودار نشان می دهد که چگونه پیک های غالب در روزهای مختلف جوجه کشی برای تخم‎ مرغ های مورد آزمایش توزیع شده اند. همچنین، این نمودار توزیع آماری داده ها را نشان می دهد که اطلاعاتی در مورد شاخص های مرکزی را در بر دارد. در نهایت، بیشترین تفاوت شدت فلورسانس در روز ۳/۵ جوجه کشی ثبت شد، جایی‎ که طیف فلورسانس خون نر و ماده شکل های متمایزی را نشان داد. پس از روز ۴ جوجه‎ کشی، شدت فلورسانس در جوجه های نر بیشتر باقی ماند، اما شکل طیفی به ‎سرعت کاهش یافت و تا روز ۵ به ‎طور کامل از بین رفت. این تفاوت ها به ‎‎دلیل تفاوت در تولید گلبول های قرمز و هموگلوبین متفاوت بین دو جنس و تاثیر کروموزوم های جنسی بر ساختار گنادها هستند. تفاوت در مقدار هموگلوبین به تفاوت در اشباع اکسیژن خون نرها و ماده ها مرتبط است، به ‎طوری ‎که خون نر احتمالا دارای میل اکسیژن بیشتری نسبت به خون ماده است. جوجه های نر دارای کروموزوم های ZZ و جوجه های ماده دارای کروموزوم های ZW هستند که این تفاوت در ساختار ژنتیکی منجربه تمایز در ویژگی های فیزیولوژیک و بیوشیمیایی و تمایز در ساختار گنادها می شود. برای تایید نتایج تعیین جنسیت توسط طیف سنجی میکرورامان از واکنش زنجیره‎ای پلیمراز استفاده شد. نتایج الکتروفورز ژل آگاروز، دو باند با طول‎ های ۴۶۱ و ۳۲۲ جفت ‎باز را برای جنین‎ های با جنسیت ماده (ZW) و یک قطعه به طول ۴۶۱ جفت‎باز را برای جنین‎ های با جنسیت نر (ZZ) نشان دادند. نتیجه‎ گیری: با توجه به بررسی ‎های انجام ‎شده در این مطالعه، روز ۳/۵ انکوباسیون به ‎‎عنوان مناسب ‎ترین زمان برای تعیین جنسیت جنین مرغ بومی با استفاده از طیف سنجی میکرو رامان شناخته شد. از جمله مزایای روش های طیف سنجی و فلورسانس شامل دقت زیاد و زمان تحلیل کوتاه هستند که می توانند به توسعه سیستم های صنعتی برای تعیین جنسیت تخم مرغ ها کمک کنند. این روش ترکیبی از تکنیک های پیشرفته طیف سنجی رامان و تجزیه و تحلیل ژنتیکی برای تعیین جنسیت جوجه ها در مراحل اولیه جوجه کشی را ارائه می دهد که می تواند به ‎طور موثری در صنعت طیور مورد استفاده قرار گیرد.

کلیدواژه ها:

Sex determination ، Chicken embryo ، Raman spectroscopy ، تعیین جنسیت ، جنین مرغ ، طیف‎سنجی رامان