طراحی و کلون سازی سازه یGFP eSpCas۹(۱.۱) با اختصاصیت بهبود یافته برای سیستم CRISPR/Cas۹

ویرایش ژن به مجموعه ای از فناوری ها اطلاق می شود که به پژوهشگران امکان تغییر و دست کاری توالی DNA را در سلول ها می دهد و می تواند منجر به اضافه کردن، حذف یا اصلاح مواد ژنتیکی در نواحی خاصی از ژنوم شود. فناوری CRISPR/Cas۹ به عنوان یکی از جدیدترین و کارآمدترین ابزارهای ویرایش ژنوم، قادر است با ایجاد شکست های دو رشته ای در DNA، باعث تخریب یا خاموش سازی ژن های هدف گردد. انتقال کارآمد سیستم CRISPR/Cas۹ به سلول های هدف و افزایش اختصاصیت آن، از چالش های مهم در بهبود کارایی و کاربردهای درمانی این سیستم به شمار می روند. در این مطالعه، با هدف بهبود اختصاصیت عملکرد و تسهیل شناسایی سلول های ترانسفکت شده، سازه ی نوترکیب GFP-eSpCas۹(۱.۱) طراحی و کلون سازی شد. در این طراحی، توالی کدکننده پروتئین GFP به همراه پروموتر SSFV در ناحیه ی ۵’ و توالی SV۴۰ polyA در ناحیه ی ۳’ به سازه اضافه گردید تا امکان بیان پایدار پروتئین فلورسنت فراهم شود. برای تسهیل کلونینگ، جایگاه شناسایی آنزیم محدودکننده NotI از طریق واکنش PCR در ابتدای توالی GFP وارد شد و پلاسمید eSpCas۹(۱.۱) با آنزیم های SmaI و NotI هضم و سپس با توالی GFP توسط آنزیم T۴ DNA ligase لایگیت گردید. پلاسمیدهای نوترکیب به درون باکتری مستعد E. Coli Stbl۳ ترانسفورم و کلون های منفرد غربال شدند. سازه ی نهایی علاوه بر دارا بودن نواحی کدکننده Cas۹ و RNA راهنما و ژن مقاومت به پنی سیلین، قادر به بیان GFP نیز هست که امکان شناسایی مستقیم کلون های واجد سازه و سلول های حامل را فراهم می کند. این طراحی با افزایش اختصاصیت و سهولت پایش سلول های ترانسفکت شده، می تواند به عنوان ابزاری کارآمد در مطالعات سلولی، مولکولی و کاربردهای بالقوه ژن درمانی مبتنی بر CRISPR/Cas۹ مورد استفاده قرار گیرد.

کلیدواژه ها:

کریسپر ، کلونینگ ، GFP ، وکتور