طبقه‎ بندی فیلوژنتیکی برخی ارقام نخل خرمای استان سیستان و بلوچستان بر اساس ژن کلروپلاستی matK

چکیده مبسوط مقدمه و هدف: نخل خرما با نام علمی (LPhoenix dactylifera ) گیاهی تک ‎لپه از خانواده Palmaceae است که کشت آن در دنیا و همچنین در ایران از یک سابقه طولانی برخوردار بوده است و در نواحی گرمسیری و نیمه گرمسیری و بسیاری از کشورها از جمله ایران پرورش می یابد. امروزه با پیشرفت علم، روش های شناسایی مولکولی در مطالعات سیستماتیک جایگاه ویژه ای پیدا کرده ‎اند. یکی از این روش ‎ها بررسی و مقایسه ساختار ژن‎ ها و قطعات DNA دارای توالی های محافظت شده ای است که طی فرایند های تکاملی در گونه ها و ارقام مختلف ساختار منحصر به‎ فرد خود را حفظ نموده‎ اند که به اصطلاح DNA بارکدینگ نامیده می‎ شوند. DNA بارکدینگ یک ابزار ارزشمند برای ارزیابی روابط فیلوژنتیک فراهم آورده است. در این روش، بخش کوچکی از ژنوم گیاه توالی یابی شده و برای مطالعه تنوع جمعیت ها و تعیین روابط خویشاوندی بین گونه های مختلف مورد استفاده قرار می گیرد. بر همین اساس، در گیاهان نواحی مختلف از DNA هسته ‎ای (ITS، ITS۲) و کلروپلاستی (rbcL، matK، trnH-psbA، atpF-atpH، nhdJ، psbK-psbI) به ‎عنوان بارکد پیشنهاد شده است. ژن کلروپلاستی matK که دارای سرعت تکاملی بالا در سطوح نوکلئوتیدی و آمینواسیدی است، یکی از مناسب‎ ترین ژن‎ های کلروپلاستی برای حل روابط فیلوژنی و تکاملی در گستره ‎ای از سطوح تاکسونومیک از سطح گونه تا جنس، تیره و حتی فراتیره ‎ای در میان گیاهان به ‎ویژه نهان‎دانگان است. این ژن می ‎تواند به‎ صورت تکی یا همراه با ژن‎ های دیگر برای شناسایی و معرفی گونه‎ های ناشناخته استفاده شود. بررسی تنوع ژنتیکی ذخایر ژرم ‎پلاسم موجود جهت اصلاح و تکثیر ارقام دارای صفات مطلوب امری ضروری است و اولین قدم در این فرایند شناسایی ارقام موجود و دسته ‎بندی آن‎ها است. با توجه به اهمیت تولید خرما در کشور، جستجوی ارقام جدید، اصلاح ارقام موجود و بررسی تنوع موجود بین ارقام مختلف از راهکارهای مهم برای بهبود کمی و کیفی تولید خرما است. از آنجا که مطالعات زیادی در زمینه بررسی و تعیین میزان قرابت یا فاصله ژنتیکی ارقام مختلف خرما با استفاده از نشانگرهای ژنتیکی مناسب، صورت نگرفته ‎اند، لذا هدف از این پژوهش تعیین فاصله ژنتیکی، تعیین شباهت و دسته بندی ارقام نخل خرمای مورد مطالعه با استفاده از نشانگر matK بود تا با ترسیم درخت فیلوژنتیکی و مقایسه آنها با یکدیگر، مناسب بودن این نشانگر برای بررسی تنوع ژنتیکی و گروه ‎بندی ارقام مذکور مورد بررسی قرار گیرد. مواد و روش ها: در این تحقیق، به‎ منظور بررسی تنوع ژنتیکی موجود بین ۱۵ رقم محلی خرما از شهرستان سراوان و بخش های جالق، ناهوک و سینوکان استان سیستان و بلوچستان، از ژن کلروپلاستی matK استفاده شد. استخراج DNA از برگ ‎های جوان ارقام مختلف با استفاده از روش دلاپورتا (۱۹۹۳) انجام شد و در ادامه کیفیت و کمیت DNA با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز یک و نیم درصد و دستگاه اسپکتوفتومتر تعیین گردید. با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن matK، واکنش زنجیره ‎ای پلیمراز انجام شد که قطعه حدود bp ۹۰۰ تکثیر گردید. سپس محصولات PCR جهت توالی ‎یابی ارسال شدند. کیفیت نتایج حاصل از تعیین توالی بررسی شد و سپس با استفاده از نرم افزار BioEdit همتراز و نواحی دارای کیفیت توالی یابی پایین از دو انتهای '۳ و '۵ حذف شدند. توالی ‎ها پس از ثبت، جهت هم ترازی با سایر توالی های موجود در پایگاه داده NCBI بلاست شدند و میزان تشابه با سایر توالی های ثبت شده مورد بررسی قرار گرفت. بعد از هم ردیف کردن توالی ها، برخی پارامترهای ژنتیکی مانند تعداد جهش ها، تنوع نوکلئوتیدی، تعداد جایگاه هایی که در آنها جهش اتفاق افتاده بود و همچنین تنوع آنها مورد بررسی قرار گرفتد. در ادامه، جهت تعیین روابط خویشاوندی و فاصله ژنتیکی بین ارقام مورد مطالعه از نرم افزارهای MEGA۷ و همچنین برای ترسیم درخت فیلوژنی از روش خوشه ‎بندی UPGMA استفاده شد. یافته ها: مقایسه توالی ‎ها همولوژی بالایی را بین این توالی ‎ها با توالی های گونه Phoenix dactylifera موجود در بانک ژن نشان داد. نتایج توالی‎ یابی ارقام مورد بررسی در پایگاه داده NCBI ثبت گردید. برای این نشانگر در مجموع ۱۰۱۹ موقعیت شناسایی شد که ۶۷۲ جایگاه دارای حذف و اضافه، و ۳۴۷ جایگاه بدون حذف و اضافه بودند. در این جمعیت، ۱۵ هاپلوتایپ و همچنین چهار ناحیه حفاظت­ شده DNA برای نشانگر matK شناسایی شدند. مقدار عددی نسبت جایگزینی (dN/dS) برابر ۰/۱۶۹ بود و فاصله ژنتیکی نیز در دامنه ۰/۰۱۹ تا ۱/۲۳۸ مشاهده شد. بیشترین فاصله ژنتیکی (۱/۲۳۸) بین نمونه ‎های هلیله ۲۰ از سراوان و پیمازو ۱۶ از جالق مشاهده شد. پس از ترسیم درخت فیلوژنتیکی، ارقام مورد مطالعه به سه شاخه تقسیم شدند که در شاخه اول رقم هلیله ۲۰ که از شهرستان سراوان جمع ‎آوری شده بود، قرار گرفت. در شاخه دوم، رقم پیمازو ۱۶ از جالق قرار گرفت. شاخه سوم خود به دو زیرشاخه تقسیم شد که در زیر شاخه فرعی اول در مجموع شش رقم و در زیر شاخه فرعی دوم در مجموع هفت رقم قرار گرفتند. بر اساس این تقسیم ‎بندی، رقم هلیله ۲۰ از سراوان بیشترین فاصله را با سایر ارقام دارد. نتیجه گیری: بر اساس نتایج حاصله می‎ توان نتیجه گرفت که استفاده از نشانگر matK برای مطالعه و شناخت تنوع و روابط درون‎ گونه ای خرما مفید و مناسب است. بنابر این، در مطالعات آتی بررسی تنوع ژنتیکی خرما، می ‎توان استفاده از این بارکد را در کنار سایر نشانگرهای مولکولی مناسب پیشنهاد نمود.

کلیدواژه ها:

Data palm ، DNA barcoding ، Genetic distance ، matK marker ، Phylogenetic relationships ، بارکدینگ DNA ، روابط فیلوژنتیک ، فاصله ژنتیکی ، نخل خرما ، نشانگر matK