بررسی ازنو اطلس بیانی بیوسنتز اسید چرب و توکوفرول در گیاه دانه روغنی گلرنگ، رقم زراعی گلدشت

چکیده مبسوط مقدمه و هدف: گیاه دانه روغنی گلرنگ (Carthamus tinctorius L.) دارای ویژگی های زراعی و عملکردی مطلوبی است که آن را به گزینه ای مناسب برای اهداف کاربردی مختلف و دستیابی به توسعه پایدار در صنعت غذا، انرژی و دارو تبدیل می کند. این گیاه کاربردهای مختلفی از جمله استفاده های پزشکی، صنعتی و تغذیه ای دارد. کیفیت بالای روغن (بیش از ۹۰ درصد اسیدهای چرب غیراشباع اولئیک و لینولئیک)، تحمل بالا در برابر تنش های غیرزیستی (سرما، شوری و خشکی) و دامنه وسیع کشت، همیشه مورد توجه بوده‎اند. آگاهی از اطلس بیانی این گیاه در طول دوره ی رشد و نمو برای بهینه سازی و تکامل ویژگی های زراعی، بهبود عملکرد، کیفیت محصول و اطمینان از عوامل تغذیه ای و سلامتی که امکان تولید یک محصول کاربردی را فراهم می کند، بسیار مهم است. کشت و کار این گیاه صنعتی به واسطه ی کیفیت مطلوب روغن استحصال ­شده از بذور آن اخیرا در کشورهای با اکوسیستم گرم و خشک، مورد توجه قرار گرفته است. عوامل محدودکننده در تسریع برنامه های اصلاحی گلرنگ، کمبود دانش دقیق در مورد ساختار ژنوم و عملکرد ژن ها به‎منظور بهبود کیفیت و کمیت این گیاه است. بیشتر مطالعات NGS گلرنگ برای بررسی تنوع ژنتیکی و شناسایی نشانگرهای مولکولی در گلرنگ انجام شده‎اند. در این مطالعه، عوامل مولکولی دخیل در بیوسنتز اسیدهای چرب و توکوفرول بذرهای گلرنگ بر پایه داده های RNA-seq مورد بررسی قرار گرفته ‎اند. مواد و روش ها: در این تحقیق، رقم گلدشت از میان ارقام بومی و تجاری گلرنگ موجود در کشور انتخاب شد. این رقم دارای ویژگی های برجسته ای از جمله تحمل بالا به شوری و خشکی، گل های قرمز، عدم وجود خار، ارتفاع متوسط و قوزه های بزرگ است. بذور در سال زراعی ۹۷-۹۸ و در مزرعه تحقیقاتی پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری کشت شدند. نمونه گیری با نظارت روزانه در خصوص رشد گیاه پس از آغاز رشد زایشی از بافت بذر انجام شد. نمونه ها از مراحل نمو بذر شامل تشکیل بذر (۱۴ روز پس از شروع گلدهی)، پر شدن بذر (۲۸ روز پس از شروع گلدهی) و رسیدن فیزیولوژیک (۳۵ روز پس از شروع گلدهی) برای بررسی ازنو اطلس ترانسکریپتوم نمو بذر گلرنگ جمع آوری شدند. هر نمونه شامل پنج زیرتکرار و دو تکرار بود. RNA کل از نمونه ها با استفاده از روش تغییریافته ترایزول استخراج شد. در این مطالعه از پلتفرم  BGISEQ-۵۰۰برای توالی یابی استفاده شد و خوانش هایی با طول ۱۰۰ جفت باز برای هر کتابخانه به ‎صورت pair-end تولید کرد. برای ارزیابی کیفیت و پاکسازی خوانش های خام هر کتابخانه، به ‎ترتیب از نرم افزارهای FastQC و Trimmomatic استفاده شد. برای سرهم بندی خوانش های فیلترشده همه نمونه ها از نرم‎ افزار Trinity استفاده شد. ترانسکریپت های با بیان متمایز (DETs) و خوشه بندی آنها با استفاده از بسته DESeq۲ در R به‎ دست آمد. حاشیه ‎نویسی عملکردی با استفاده از Trinotate و غنی سازی ژن با استفاده از بسته goseq در R و شناسایی مسیرهای بیوشیمیایی با استفاده از پایگاه داده KEGG انجام شدند. یافته ها: در نتیجه توالی یابی به‎ طور متوسط از هر کتابخانه بالغ بر ۷۱ میلیون خوانش به دست آمد. در نتیجه سرهم بندی ازنو و ایجاد ترانسکریپتوم مرجع، نرخ هم ردیفی داده های خام بر علیه فایل نهایی سرهم بندی شده ۲۹/۹۷ درصد بود. پس از غربالگری داده ها، تعداد ۸۶،۵۸۵ ترانسکریپت در قالب ۶۸،۸۰۹ ژن دسته بندی شدند. در مجموع، تعداد ۱۶،۷۵۵ ترانسکریپت با بیان افتراقی شناسایی گردید. بیشترین میزان ترانسکریپت های شناسایی شده با بیان افتراقی در مقایسات دوتایی و در طول مراحل نمو بذرمربوط به فاز گذر از مرحله ی پر شدن بذر (seed filling) به مرحله ی بلوغ بذر (seed maturation) با ۱۰،۱۹۸ ترانسکریپت بود. بر اساس نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل داده های اطلس ترانسکریپتوم بذر، سه الگوی اصلی بیان ژن مشهود بود. بیشتر ژن ها در ۱۴ روز پس از گل دهی (DAF) به اوج رسیدند که هم زمان با افزایش سریع محتوای روغن در طول توسعه بذر بود. ژن هایی که در ۱۴ و ۲۸ روز پس از گل دهی بیان بالایی داشتند، با تشکیل متابولیت ها و مراحل اولیه سنتز روغن، از جمله تشکیل پیرووات و استیل-CoA، مرتبط بودند. همچنین، ژن های مرتبط با ذخیره سازی پروتئین در ۳۵ روز پس از گل دهی به اوج خود رسیدند. ژن ها با استفاده از پنج پایگاه داده عمومی (NR، COG، Swiss-Prot، KEGG و GO) شناسایی شدند. در پایگاه داده KEGG، همه ژن های شناسایی ­شده در ۳۹۸ مسیر زیستی و هشت دسته عملکردی طبقه بندی شدند که بیوسنتز اسید چرب و توکوفرول با سنتز متابولیت های لیپید و یوبی کینون در طول رشد و توسعه بذر گلرنگ مرتبط بودند. نتیجه گیری: پروفایل بیان ژن های درگیر در بیوسنتز اسیدچرب غیر اشباع، نشان از تمرکز بیان آنها در مرحله اول نمو بذر داشت. همچنین، این میزان بیان در مرحله بلوغ در کمترین میزان خود قرار داشت. بررسی پروفایل بیانی ژن های درگیر در مسیر متابولیکی بیوسنتز توکوفرول نشان از تمرکز بروز این ژن ها در مراحل میانی و پایانی نمو بذر داشت که نشان دهنده رابطه زمانی واضح بین تجمع روغن و تغییرات فیزیولوژیکی در دانه های گلرنگ است. این مطالعه بیان می ‎کند که اوج بیان ژن های مرتبط با بیوسنتز اسیدهای چرب زودتر از توسعه دانه ها رخ می دهد. همچنین، تجمع روغن قبل از تجمع پروتئین ها در دانه های گلرنگ آغاز می شود. شناسایی عوامل مولکولی دخیل در بهبود عملکرد گیاه و تبیین ارتباط بین آنها با یکدیگر و همچنین محیط، می ‎تواند ابزار ارزشمندی برای مدیریت بهتر زراعی و فعالیت های اصلاحی در اختیار اصلاح‎ گران قرار دهد.

کلیدواژه ها:

De novo RNA-seq ، Gene expression ، Safflower ، Tocopherol ، Unsaturated fatty acids ، اسید چرب غیر اشباع ، بیان ژن ، توکوفرول ، گلرنگ ، De novo RNA-seq