مهندسی و تولید پروتئین ریسین نوترکیب با هدف تولید ایمونوتوکسین موثر

متابولیت ریسین یک گلیکوپروتئین سمی است که در آندوسپرم گیاه کرچک یافت می شود. این پروتیین شامل دو زنجیره A با ۲۶۷آمینواسید (۳۲کیلودالتون) و زنجیرهB با ۲۶۲آمینو اسید (۳۴کیلودالتون) می باشد که بوسیله پیوند دی سولفیدی به هم متصل هستند. حساسیت سلول های سرطانی به ریسین به دلیل بیان بیشتر گلیکوپروتئین های موجود در سطح سلول های سرطانی است. سمیت آنزیم ریسین در از بین بردن سلول ها سبب شد که این آنزیم به عنوان مهمترین انتخاب در تولید ایمونوتوکسین ها بکار گرفته شود. با این حال، توانایی پایین ریسین در ورود به سلول هدف با استفاده از مسیر دستگاه گلژی، سبب بالا رفتن سمیت سلولی شده، که این نقص، استفاده از آن را در ایمونوتوکسین ها تحت تاثیر قرار داده است. این پژوهش با هدف مهندسی پروتئین ریسین به منظور افزایش بارالکتریکی سطحی پروتئین و تسهیل ورود ریسین به داخل سلول از طریق مسیر اندوزومیک و کاهش اثر سمیت سلولی صورت پذیرفت. مواد و روش ها: وضعیت ساختاری پروتئین ریسین با ایجاد جهش های R۱۳۴A، L۲۱۴A، R۳۱A ، P۲۵۰A و در مقایسه با نمونه طبیعی این آنزیم با استفاده از مطالعات ترمودینامیکی مورد بررسی قرار گرفت. سپس توالی ژنی مربوط به نسخه جهش یافته، سنتز و با استفاده از وکتور بیانی pET۲۲b(+) در فضای پیروپلاسمی سلولی باکتری اشریشیاکلی BL۲۱(DE۳) بیان شد. خالص سازی با استفاده از ستون Ni-NTA انجام و سپس عملکرد پروتئین بر رده سلول های سرطانی پوست A۴۳۱ با استفاده از آزمون سمیت سلولی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج: جهش های ایجاد شده به شکل چشمگیری سبب افزایش بارالکتریکی سطحی پروتئین شده است. مقایسه آنالیز نمودارهای RMSD (انحراف جذر میانگین مربعات)، RMSF (نوسانات جذر میانگین مربعات) و Rg (شعاع ژیراسیون) بین نمونه طبیعی و موتانت مشخص کرد که جهش ها هیچ تاثیر معنی داری بر ساختار اصلی پروتئین ندارد. تایید تولید و خالص سازی پروتئین نوترکیب ریسین در دیواره سلولی با وزن مولکولی حدود ۳۳ کیلودالتون با استفاده از ژل SDS-PAGE انجام شد. این فرم نوترکیب نسبت به فرم طبیعی از وزن مولکولی کمتری برخوردار است. نتایج سمیت سلولی نشان داد که پروتئین ریسین موتانت قادر است در غلظت ng/mL ۳۰۰ سبب مرگ سلولی سلول های سرطانی A۴۳۱ گردد.نتیجه گیری: نتایج In silico و In vitro بدست آمده در این مطالعه بر روی پروتئین ریسین نشان داد که ایجاد جهش های هدفمند به منظور افزایش بارالکتریکی سطحی پروتئین می تواند به شکل موثری سبب بهبود عملکرد پروتئین گردد. از این رو، پروتئین ریسین موتانت (R۱۳۴A، L۲۱۴A، P۲۵۰A وR۳۱A) با قابلیت ورود سلولی بیشتر و سمیت کمتر برای سلول ها ی هدف، قابلیت خوبی به عنوان توکسین در تولید ایمونوتوکسین ها دارد.

کلیدواژه ها:

ریسین ، سمیت سلولی ، پروتئین نوترکیب ، سرطان