مهندسی آنزیم اوریکاز آسپرژیلوس فلاووس در موقعیت۲۷۹ با استفاده از جهش زایی هدفدار برای بهبود پایداری

آنزیم اوریکاز یا اورات اکسیداز جزء دسته اکسیدازهای بدون کوفاکتور می باشد. آنزیم اوریکاز آسپرژیلوس فلاووس باعث کاتالیز اسیداوریک به -۵هیدروکسی ایزواورات وهیدروژن پراکسید میشود که در نهایت این ترکیب طی واکنش غیر آنزیمی به یک ترکیب قابل دفع به نام آلانتوئین تبدیل می شود. اوریکاز یک آنزیم اصلی در تجزیه نوکلئوتیدهای پورینی می باشد. این آنزیم توزیع گسترده ای درمیان میکروارگانیسم ها دارد اما انسان ها وتعدادی از نخستی های عالی به علت جهش های بی معنی در دوره میوسن این آنزیم را از دست داده اند. هدف این مطالعه جایگزینی اسید آمینه آلانین در موقعیت۲۷۹ به سیستئین جهت بررسی پایداری آنزیم اوریکاز می باشد. برای بررسی این موضوع از مطالعات بیوانفورماتیکی از قبیل سرورهای-IMutant، I-Stable استفاده کردیم. در این تحقیق از پلاسمید pET۲۸a(+) حاوی ژن اوریکاز وباکتریE.coli سویه BL۲۱ مورد استفاده قرار گرفت. جهش زایی هدفدار به روش Quick-change PCR به منظور ایجاد جهش نقطه ای با استفاده ازpfu DNA polymeras انجام شد و از کروماتوگرافی میل ترکیبی Ni-NTA برای تخلیص پروتئین استفاده شد. پس از خالص سازی، دمای بهینه ۲۵، ۲۵ و همچنین pH بهینه ۸، ۹ به ترتیب برای آنزیم جهش یافته و وحشی به دست آمد. همچنین پایداری حرارتی آنزیم جهش یافته در دماهای ۴۰، ۵۰ و ۶۰ درجه سانتی گراد تقریبا ۸۰ درصد فعالیت خود را از دست داده است. بنابراین به منظور پایدارسازی آنزیم های دارویی، از روش جهش زایی هدفدار می توان استفاده کرد.

کلیدواژه ها:

اوریکاز ، دمای بهینه ، پایداری حرارتی ، آسپرژیلوس فلاووس